【文章內(nèi)容簡介】 毒理學評價試驗和方法 急性毒性試驗 鼠傷寒沙門氏菌 /哺乳動物微粒體酶試驗 骨髓微核試驗 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗 小鼠精子畸變試驗 小鼠睪丸染色體畸變試驗 顯性致死試驗 非程序性 DNA 合成試驗 果蠅伴性隱性致死試驗 體外哺乳類細胞（ V 79/HGPRT）基因突變試驗 TK 基因突變試驗 30 天和 90 天喂養(yǎng)試驗 致畸試驗 繁殖試驗 代謝試驗 慢性毒性和致癌試驗 日容許攝入量（ ADI）的制定 致突變物，致畸物和致癌物的處理方法 “好好學習天天向上” 打造中國最大的學習資源平臺！ 免費培訓 : 免費下載 : 一、急 性 毒 性 試 驗 Acute Toxicity Test 1 范圍 本方法規(guī)定了急性毒性試驗的基本技術(shù)要求。 本方法適用于評價保健食品的急性毒性作用。 2 術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本方法。 LD50：半數(shù)致死量（ median lethal dose,LD50）是經(jīng)口給予受試物后，預期能夠引起動物死亡率為 50％的單一受試物劑量，該劑量為經(jīng)過統(tǒng)計得出的估計值。其單位是 每公斤體重所攝入受試物質(zhì)的毫克數(shù)、克數(shù)或毫升數(shù)，即 mg/kgBW、 g/kgBW 或 ml/kgBW。 最大耐受劑量法（ Test of Maximum Tolerated Dose）：用最大使用濃度和最大灌胃容量給予 20 只動物后，連續(xù)觀察 7－ 14 天，未見任何動物死亡，則 MTD 大于 ╳╳ g/kgBW 。 3 原理 經(jīng)口一次性給予或 24h 內(nèi)多次給予受試物后，在短時間內(nèi)觀察動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，包括致死的和非致死的指標參數(shù)，致死劑量通常用半數(shù)致死劑量 LD50 來表示。 4 實驗動物 一般均分別用兩種性別的成年 小鼠或 /和大鼠。小鼠體重為 18～ 22g，大鼠體重為180～ 220g。如對受試物的毒性已有所了解，還應(yīng)選擇對其敏感的動物進行試驗，如對黃曲霉素選擇雛鴨，對氰化物選擇鳥類。動物購買后適應(yīng)環(huán)境 3－ 5 天。 5 操作步驟 受試物的處理： 受試物應(yīng)溶解或懸浮于適宜的介質(zhì)中。一般采用水或食用植物油作溶劑，可以考慮用羧甲基纖維素、明膠、淀粉等配成混懸液；不能制時，可其它形式（如糊狀物等）。必要時可采用二甲基亞砜。但不能采用具有明顯毒性的有機化學溶劑。如采用有毒性的溶劑應(yīng)單設(shè)溶劑對照組觀察。 受試物的給予 途徑：經(jīng)口。 試驗前空腹：動物應(yīng)隔夜空腹（一般禁食 16 h 左右，不限制飲水）。 容量：各劑量組的灌胃容量相同（ ml/kgBW），小鼠常用容量為 ml/20gBW；大鼠常用容量為 。 方式：一般一次性給予受試物。也可一日內(nèi)多次給予（每次間隔 4～ 6 h ， 24 h 內(nèi)“好好學習天天向上” 打造中國最大的學習資源平臺！ 免費培訓 : 免費下載 : 不超過 3 次，盡可能達到最大劑量，合并作為一次劑量計算）。 幾種常用的急性毒性試驗設(shè)計方法 霍恩氏（ Horn）法 預試驗：可 根據(jù)受試物的性質(zhì)和已知資料，選用下述方法：一般多采用 、 和 g/kgBW 的劑量，各以 2～ 3 只動物預試。根據(jù) 24h 內(nèi)死亡情況，估計 LD50 的可能范圍，確定正式試驗的劑量組。也可簡單地采用一個劑量，如 215 mg/kgBW，用 5 只動物預試。觀察 2h 內(nèi)動物的中毒表現(xiàn)。如癥狀嚴重，估計多數(shù)動物可能死亡，即可采用低于 215 mg/kgBW 的劑量系列，反之癥狀較輕，則可采用高于此劑量的劑量系列。如有相應(yīng)的文獻資料時可不進行預試。 動物數(shù)：一般每組用 5 只。 常用劑量 系列： 10t t=0，177。 1， 177。 2，177。 3 因為劑量間距較 t10 ? t=0，177。 1， 177。 2，177。 3 為小，所以結(jié)果較為精確。一般試驗時，可根據(jù)上述劑量系列設(shè)計 5 個組，即較原來的方法在最低劑量組以下或最高劑量組以上各增設(shè)一組，這樣在查表時容易得出結(jié)果。 正式試驗：將動物在實驗動物房飼養(yǎng)觀察 3～ 5 天，使其適應(yīng)環(huán)境，證明其確系健康動物后，進行隨機分組。給予受試物后一般觀察 7 或 14 天，若給予后的第 4 天繼續(xù)有死亡時，需觀察 14 天，必要時延長到 28 天。記錄死亡數(shù)，查表求得 LD50，并記錄死亡時間及中毒表現(xiàn)等。 該方法的優(yōu)缺點：優(yōu)點是簡單易行，節(jié)省動物；缺點是所得 LD50 的可信限范圍較大，不夠精確。但經(jīng)多年來的實際應(yīng)用與驗證，同一受試物寇氏法所得結(jié)果極為相近。因此對其測定的結(jié)果應(yīng)認為是可信與有效的。 寇氏（ Korbor）法 預試驗：除另有要求外，一般應(yīng)在預試中求得動物全死亡或 90％ 以上死亡的劑量和動物不死亡或 10％ 以下死亡的劑量，分別作為正式試驗的最高與最低劑量。 動物數(shù)：除另有要求外，一般設(shè) 5～ 10 個劑量組，每組 6～ 10 只動物為宜。 劑量：將由預試驗得出的最高、最低劑量換算為常用對數(shù)，然后將最高、最低劑量的對數(shù)差，按所需要的組數(shù)，分為幾個對數(shù)等距（或不等距）的劑量組。 試驗結(jié)果的計算與統(tǒng)計 列試驗數(shù)據(jù)及其計算表 包括各組劑量（ mg/kgBW， g/kgBW），劑量對數(shù)（ X），動物數(shù)（ n），動物死亡數(shù)（ r），動物死亡百分比（ P，以小數(shù)表示），以及統(tǒng)計公式中要求的其它計算數(shù)據(jù)項目。 LD50 的計算公式 根據(jù)試驗條件及試驗結(jié)果，可分別選用下列三個公式中的一，求出 logLD50，再查其自然數(shù)，即 LD50（ mg/kgBW， g/kgBW）。 按本試驗設(shè)計得出的任何結(jié)果，均可用式（ 1）： “好好學習天天向上” 打造中國最大的學習資源平臺！ 免費培訓 : 免費下載 : ))((21LDl og 1150 iiii PPXX ??? ??...........................（ 1） 式中： Xi 與 Xi+1 及 Pi+1 與 Pi 分別為相鄰兩組的劑量對數(shù)以及動物死亡百分比。 . 按本試驗設(shè)計且各級間劑量對數(shù)等距時，可用式（ 2）： )(2LDlog 150 ???? ii PPdXK ...................................（ 2） 式中： XK最高劑量對數(shù)，其它同式（ 1）。 若試驗條件同 且最高、最低劑量組動物死亡百分比分別為 100（全死）和 0（全不死時），則可用便于計算的式（ 3）。 logLD50=XKd（∑ P－ ） ......................................（ 3） 式中：∑ P－－ 各組動物死亡百分比之和，其它同式（ 2）。 標準誤與 95％可信限 logLD50 的標準誤（ S）： S logLD50=dn PP ii )1( ??...................................（ 4） 95％可信限（ X）： X = log_1（ logLD50177。S logLD50） ..........................（ 5） 此法易于了解，計算簡便，可信限不大，結(jié)果可靠，特別是在試驗前對受試物的急性毒性程度了 解不多時，尤為適用。 機率單位 對數(shù)圖解法 預試驗：以每組 2－ 3 只動物找出全死和全不死的劑量。 動物數(shù)：一般每組不少于 10 只，各組動物數(shù)量不一定要求相等。 劑量及分組：一般在預試得到的兩個劑量組之間擬出等比的六個劑量組或更多的組。此法不要求劑量組間呈等比關(guān)系，但等比可使各點距離相等，有利于作圖。 作圖計算 將各組按劑量及死亡百分率，在對數(shù)概率紙上作圖。除死亡百分率為 0％及100 ％者外，也可將劑量化成對數(shù)， 并將百分率查概率單位表得其相應(yīng)的概率單位作點于普通算術(shù)格紙上， 0 ％及 100 ％ 死亡率在理論上不存在，為計算需要： ％改為 N 100%0 ? ， 100％改為 NN )(100% ?? N 為該組動物數(shù)，相當于 0％及 100％ 的作業(yè)圖用概率單位。 劃出直線，以透明尺目測，并照顧概率。 計算標準誤 39。 2N 2SSE /? ........................................（ 6） 式中： N39。－概率單位 ～ 之間（反應(yīng)百分率為 ～ 之間）各組動物數(shù)之和； SE －－標準誤； 2S－－ LD84 與 LD16 之差，即 2S=LD84－ LD16（或 ED84－ ED16）。 相當于 LD84 及 LD16 的劑量均可從所作直線上找到。也可用普通方格紙作圖，查表“好好學習天天向上” 打造中國最大的學習資源平臺！ 免費培訓 : 免費下載 : 將劑量換算成對數(shù)值，將死亡率換算成概單位，方格紙橫坐標為劑量對數(shù)縱概率單位，根據(jù)劑量對數(shù)及概率單位作點連成線，由概率單位 5 處作一水平線與直線相交，由相交點向橫坐標作一垂直線，在橫坐標上的相交點即為劑量對數(shù)值求反致死量（ LD50） 值。 最大耐受量試驗： 適宜條件：有關(guān)資料顯示毒性極小的或未顯示毒性的受試物，給予動物最大使用濃度和最大灌胃容量的受試物時，仍不出現(xiàn)死亡。 動物：至少雌、雄各 10 只。 劑量：受試物最大使用濃度和灌胃體積（一個劑量組）。 方法：動物購買后觀察 3－ 5 天，給予最大使用濃度和最大灌胃容量的受試物（一日內(nèi) 1 次或多次給予，一日內(nèi)最多不超過 3 次），連續(xù)觀察 7～ 14 天，動物不出現(xiàn)死亡，則認為受試物對某種動物的經(jīng)口急性毒性劑量大于某一數(shù)值（ g/kgBW）。最大灌胃容量小鼠為 ml/20gBW，大鼠為 。 急性聯(lián)合毒性試驗 原理 兩種或兩種以上的受試物同時存在時，可能發(fā)生作用之間的拮抗、相加或協(xié)同三種不同的聯(lián)合方式，可以根據(jù)一定的公式計算和判定標準來確定這三種不同的作用。 步驟 分別測定單個受試物的 LD50，方法同前。 按各受試物的 LD50 值的比例配制等毒性的混合受試物。 測定混合物的 LD50，用其它 LD50 測定方法時，可 以按各個受試物的 LD50 值的二分之一之和作為中組，然后按等比級數(shù)向上、下推算幾組，與單個受試物 LD50 測定的設(shè)計相同，如估計是相加作用，可向上、下各推算兩組；如能為協(xié)同則多設(shè)幾組；如可能為拮抗作用，則可向上多設(shè)幾組。 . 計算 混合物中各個受試物是以等毒比例混合的，因此求出的 LD50 乘以各受試物的比例，即可求得各受試物的劑量。 用式（ 7）計算混合物的預期 LD50 值的比值，按比值判定作用的方式。 )7(LDN nL