【文章內(nèi)容簡介】 驗設(shè)計 此處簡要討論在遺傳毒理學(xué)體外試驗共同考慮的幾個問題。 1．測定受試物溶解性 應(yīng)該測定受試物在試驗介質(zhì)中的溶解性。已注意到在試驗系統(tǒng)暴露期內(nèi)，受試物的溶解性可能改變，因為存在細(xì)胞、S血清等。因此，在試驗開始和結(jié)束時評價溶解性是有意義的。溶解性限度就是出現(xiàn)沉淀的最低濃度。 2．試驗最高劑量的推薦 對可溶性受試物濃度高于10mmol/L時可因高滲透壓在哺乳動物細(xì)胞引起損傷或人工假象，對細(xì)菌則無此影響。由于受試物的分子量并不一定知道(如聚合物或混合物)，因此，在大多數(shù)情況下，可溶性受試物的試驗上限應(yīng)該是：(1)對哺乳動物細(xì)胞為10mmol/L或5mg/ml。(2)對細(xì)菌試驗為5mg/平板。當(dāng)受試物供應(yīng)困難或非常昂貴(如生物藥劑)，最高劑量低于10mmol/L或5mg/ml(或／平扳)是可以接受的。對不溶性受試物最高濃度的推薦有爭論，日本學(xué)者的資料表明，有的受試物僅在沉淀劑量于細(xì)菌試驗和染色體畸變試驗中出現(xiàn)遺傳毒性。哺乳動物細(xì)胞具有吞噬作用，細(xì)菌不具有吞噬作用。一般認(rèn)為無毒性的可溶于適當(dāng)?shù)娜軇┒蝗苡趯嶒炁囵B(yǎng)液(介質(zhì))中的受試物，最高濃度應(yīng)是溶解性限制(即產(chǎn)生沉淀的最低濃度)，但不應(yīng)干擾終點的計數(shù)。 對于有毒性的受試物，最高濃度在細(xì)菌試驗中應(yīng)該是明顯顯示毒性的劑量，對哺乳動物細(xì)胞試驗最高劑量，基因突變試驗應(yīng)達(dá)到10％～20％存活率，而染色體畸變和UBS試驗應(yīng)達(dá)到50％存活率。 對于沒有適當(dāng)溶劑，完全不溶的受試物，則可以按5mg/平板或10mmol/L(5mg/ml)進(jìn)行實驗以檢測雜質(zhì)的致突變性?；蛘?，采用生理鹽水提取物進(jìn)行實驗。 3. 代謝活化 代謝活化常規(guī)使用Aroclor 1254（多氯聯(lián)苯1254）預(yù)處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液(S9)，及相應(yīng)的輔因子(NADPH再生系統(tǒng))。由于各國禁用限用多氯聯(lián)苯，可用苯巴比妥和β萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)制備S9(El1iott，1992)。對體外哺乳動物細(xì)胞試驗，還可利用大鼠肝原代培養(yǎng)細(xì)胞等作為代謝活化系統(tǒng)。 4. 陽性對照 陽性對照的劑量應(yīng)選擇其劑量反應(yīng)的直線部分，并且構(gòu)成歷史性資料(歷史性對照)，并以其作為實驗質(zhì)量控制的措施之一5. 重復(fù) 由質(zhì)控良好的實驗得到明確的陰性結(jié)果和陽性結(jié)果，不強調(diào)要求重復(fù)?？梢山Y(jié)果則應(yīng)重復(fù)實驗，最好改變劑量范圍／劑量間隔、改變S9濃度或改變實驗方法進(jìn)行重復(fù)。 第五節(jié) 實驗動物的柒毒和處置本節(jié)簡要介紹在動物實驗前的實驗動物準(zhǔn)備、受試物的準(zhǔn)備、染毒途徑和方法、動物處死和生物標(biāo)本采集的基本內(nèi)容，詳細(xì)的方法和步驟請查閱有關(guān)的毒理學(xué)實驗方法專著。一、動物實驗前的準(zhǔn)備 實驗動物在購進(jìn)之后，應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng)。一般應(yīng)進(jìn)行5～7天的檢疫，在此期間應(yīng)多次觀察動物，及時剔除不健康的動物。觀察期結(jié)束，將實驗動物按實驗設(shè)計的要求進(jìn)行標(biāo)記和分組。 實驗動物的標(biāo)記方法對嚙齒動物常用染色法，可用苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色，不同的顏色和染色部位表示不同的編號，可標(biāo)出1～99號。由于被毛上顏色會逐步消失，故需重復(fù)染色。對嚙齒動物還可用剪耳法標(biāo)記。對狗等大動物一般用掛牌法。實驗動物分組的原則要求所有的動物分配到各劑量組和對照組的機(jī)會均等，避免主觀選擇傾向，減少偏性，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。正確的分組方法是隨機(jī)分組。實驗動物按性別、體重順序編號，然后利用統(tǒng)計學(xué)的隨機(jī)數(shù)字表，按完全隨機(jī)分組法或配伍組隨機(jī)分組法，將實驗動物分配到各劑量組和對照組。然后應(yīng)計算各組實驗動物體重的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，必要時可將實驗動物適當(dāng)調(diào)組，以使各組實驗動物體重的均值的差別不超過允許范圍。二、受試物和樣品的準(zhǔn)備 應(yīng)了解受試物的純度及雜質(zhì)成分，了解受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，特別是其揮發(fā)性和溶解性。查閱文獻(xiàn)，檢索與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的化合物的毒性資料，以作參考。對各個毒理學(xué)試驗應(yīng)該用同一種、同一批號受試物。受試物成分和配方必須固定。如是異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必須固定?；钚猿煞值陌俜趾亢涂蓹z測的雜質(zhì)的濃度也應(yīng)固定。受試物在貯存期內(nèi)穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性必須進(jìn)行研究并報告。受試物應(yīng)一次備齊全部實驗的用量。 所需受試物總量＝(ABCD) 式中：A為每組動物數(shù)；B為各處理組的劑量和(++＝)；C為染毒次數(shù)(通常為天)；D為動物的平均體重；，防止損耗。 染毒前根據(jù)染毒途徑的不同，應(yīng)將受試物制備成一定的劑型。常用的是制備成水溶液、油溶液或混懸液。對溶劑和助溶劑的要求是，所用的溶劑或助溶劑應(yīng)該是無毒的，與受試物不起反應(yīng)，受試物在溶液中應(yīng)穩(wěn)定。對水溶性受試物，體內(nèi)試驗適當(dāng)?shù)娜軇樗?經(jīng)口染毒)和等滲鹽水(胃腸道外染毒)。水不溶性受試物應(yīng)溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中。天然植物油(如玉米油，橄欖油)可以用作為溶劑，有兩個缺點，即不可能保證得到成分完全一致的植物油，植物油中的抗氧化劑成分等可影響受試物的毒性／遺傳毒性。二甲基亞礬(DMSO)不適用于體內(nèi)實驗，因其毒性較高，并且溶于DMSO的受試物在染毒后出現(xiàn)沉淀。％羧甲基纖維素鈉或10％阿拉伯樹膠；受試物溶液應(yīng)新鮮配制，除非已證明貯存穩(wěn)定。其他的劑型見下文染毒途徑的介紹。 外源化學(xué)物用溶劑稀釋，一般講濃溶液比稀溶液毒性大，但是也有的外源化學(xué)物稀釋之后毒性反而增加，即存在所謂“稀釋毒性”，其原因尚不清楚。 在準(zhǔn)備染毒制劑時的要點：①在準(zhǔn)備制劑時加熱受試物不應(yīng)接近改變其化學(xué)性質(zhì)或物理性質(zhì)的溫度。②如受試物為固體，并且評價其對皮膚的毒性，應(yīng)保持其形狀和顆粒大小。③多成分的受試物(混合物)應(yīng)按配方配制，以使染毒制劑準(zhǔn)確地反映原混合物(即其成分不應(yīng)被選擇性地懸浮或溶解)。④制劑應(yīng)保持化學(xué)穩(wěn)定性和受試物的一致性。⑤制劑應(yīng)減少總試驗容積，利用溶劑或賦形劑的量不應(yīng)過多。⑥制劑應(yīng)易于準(zhǔn)確染毒。⑦如可能，制劑pH應(yīng)為5～9。⑧不應(yīng)用酸或堿使受試物解離(基于保護(hù)動物的原因，并避免改變腸道或腎小管內(nèi)的PH)。⑨如果應(yīng)用非胃腸道途徑，終溶液應(yīng)盡可能接近等滲。 對于各種染毒途徑的最大容積，以受試的實驗動物物種或制劑來確定。一般規(guī)定，染毒最大容積為：①經(jīng)口20ml/kg(對空腹動物)。②經(jīng)皮2ml/kg(根據(jù)體表面積計算，限于染毒的準(zhǔn)確性)；③靜脈1ml/kg(5分鐘以上)；④(一個部位)；⑤。⑥；⑦陰道：，兔1ml；⑧吸人2mg/L；⑨鼻：。染毒的通常容積(最大容積)：()ml／100g體重(BW)，()ml／100g BW 。()ml/20g B W，()ml/20g Bw；狗灌胃為50(100)ml/10 kg Bw，靜注為30(50)ml／10 kg BW。各種規(guī)范可能有不同的規(guī)定，應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行。三、染毒途徑毒理學(xué)試驗中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞經(jīng)口＞皮內(nèi)注射＞其他途徑(如經(jīng)皮等)。 1. 經(jīng)口(胃腸道)染毒 常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。 (1) 灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。一般灌胃深度從口至劍突下，最好是利用等容量灌胃法，即受試物配制成不同濃度，實驗動物單位體重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時(因小鼠消化吸收和代謝速度較快)，均不停飲水。灌胃后2～4小時提供飼料。經(jīng)口多次染毒，一般不禁食，但應(yīng)每日定時染毒。灌胃法優(yōu)點是劑量準(zhǔn)確，缺點是工作量大，并有傷及食道或誤入氣管的可能。 (2) 吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動物咽下，此法劑量準(zhǔn)確，適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。 (3) 喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。飼料中摻入受試物不應(yīng)超過5％，以免造成飼料營養(yǎng)成分改變而影響實驗動物的生長發(fā)育。喂飼法符合人類接觸受試物的實際情況，但缺點多，如適口性差的受試物，實驗動物拒食；易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。而且，實驗動物應(yīng)單籠喂飼，以食物消耗量計算其實際染毒劑量。 2. 經(jīng)呼吸道染毒 經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。 (1) 靜式吸入染毒：將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。一般50升的染毒柜接觸2小時，可放小鼠6～10只或大鼠1只。靜式吸入染毒簡易，但缺點較多，主要是隨試驗進(jìn)行氧分壓降低(因此，實驗動物數(shù)量有限制)，柜內(nèi)受試物濃度也逐漸下降(由于動物吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致)，而且實驗動物有經(jīng)皮吸收的可能。 靜式吸入染毒多以計算方法得到染毒柜內(nèi)受試物濃度，以mg/m3表示。 (2) 動式吸入染毒：由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。對設(shè)備的要求較高，優(yōu)點是在染毒過程中染毒柜內(nèi)氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定，缺點是消耗受試物的量大，并易于污染環(huán)境。動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。 動式吸入染毒柜中受試物的濃度應(yīng)實際監(jiān)測。 (3) 氣管內(nèi)注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。 3. 經(jīng)皮膚染毒 經(jīng)皮膚染毒的目的有兩種。一種是經(jīng)皮染毒毒性試驗，如經(jīng)皮LD50測定常用大鼠，皮膚致癌試驗常用小鼠。另一種是皮膚刺激和致敏試驗，皮膚刺激試驗常用兔和豚鼠，皮膚致敏試驗用豚鼠。 試驗前用機(jī)械法(剃毛)或化學(xué)法(硫化鈉或硫化鋇)脫毛。要求是不應(yīng)損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動物體表面積的10％～15％。于脫毛后24小時涂抹一定量受試物，蓋上一層塑料薄膜，再用無刺激性的膠布固定，接觸規(guī)定的時間。 4. 注射染毒 注射用藥品，應(yīng)以注射途徑染毒，對大小鼠可用靜脈注射，對非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑，如狗可用后肢隱靜脈注射，而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒，必要時可改為皮下注射。注射染毒，應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應(yīng)5～8，最好是等滲溶液，動物對高滲的耐受力比低滲強。靜脈注射應(yīng)控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。腹腔注射在遺傳毒理學(xué)實驗中有時也用，但在致畸試驗、肝UDS研究不應(yīng)該用腹腔注射，以避免可能的損傷和局部高濃度對靶器官的影響。四、實驗動物處死及生物標(biāo)本采集 1．實驗動物處死方法 應(yīng)盡量減少因處死方法不當(dāng)而影響對病理及其他指標(biāo)的檢查。大小鼠可用頸椎脫臼法，然后股動脈放血。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死。應(yīng)盡量采用適當(dāng)?shù)奶幩婪椒?，減少實驗動物的痛苦。 2．血液采集 大小鼠如需血量小可用鼠尾采血，如需血量較多可用眼眶靜脈叢采血或處死時股動脈放血采血。狗可用后肢隱靜脈抽血。不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10％。 3．尿液采集 對大小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器。對狗可用接尿法或?qū)蚍ā? 4. 病理解剖和標(biāo)本留取 毒性病理學(xué)檢查是毒理學(xué)試驗重要的組成部分，病理學(xué)研究有助于確定有害作用和靶器官。毒性病理學(xué)檢查包括大體解剖和組織病理學(xué)檢查兩部分。急性毒性試驗中在試驗期中死亡或試驗結(jié)束處死的動物都應(yīng)進(jìn)行尸體解剖，因為急性毒性試驗的目的是得到有關(guān)可能的靶器官信息以及進(jìn)行重復(fù)染毒試驗劑量設(shè)計的信息。在亞慢性、慢性、致癌試驗，病理學(xué)是一個重要的終點。(1) 大體解剖：在實驗動物處死后半小時內(nèi)進(jìn)行，解剖方法采用胸腔、腹腔臟器聯(lián)出法。應(yīng)觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。對指定的臟器稱重，并計算臟器系數(shù)。推薦的實驗動物病理解剖標(biāo)準(zhǔn)操作程序見圖51。 動物固定在解剖板上，解剖頸部(頜下腺、腮腺、局部淋巴結(jié)等) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　 取一側(cè)乳腺及腹部皮膚；開腹并擴(kuò)展切口(胰、脾、生殖器官、腎、腎上腺、直腸、胃、十二指腸、空腸、回腸、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟等) ↓ 開胸(舌、喉、氣管、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、心、肺、胸腺) ↓ 剝離左后肢(肌肉、坐骨神經(jīng)、股骨)；頭皮、耳；開顱(顱神經(jīng)、腦組織、垂體)；暴露脊髓(取出脊髓) 圖51 實驗動物病理解剖標(biāo)準(zhǔn)操作程序(中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會環(huán)境病理學(xué)組，1989)(2) 組織病理學(xué)檢查：對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應(yīng)統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應(yīng)詳細(xì)記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。必要時，請其他的病理學(xué)家對有疑問的或有爭論的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行復(fù)查。利用特殊染色、組織化學(xué)及電子顯微鏡技術(shù)可有助于毒作用機(jī)制的研究。第六節(jié) 毒理學(xué)實驗結(jié)果處理和分析 在毒理學(xué)試驗的設(shè)計和實施中應(yīng)貫徹實驗設(shè)計的對照、隨機(jī)和重復(fù)的原則，實驗的各劑量組所得到的結(jié)果應(yīng)與陰性對照組比較。根據(jù)實驗結(jié)果(指標(biāo))的變量類型是數(shù)值變量(計量資料)還是分類變量(計數(shù)資料)，選用不同的統(tǒng)計分析方法。近年來，隨著毒理學(xué)的研究方法的發(fā)展，也對生物統(tǒng)計學(xué)提出了更高的要求。 在評價毒理學(xué)試驗的結(jié)果時，應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計檢驗的假設(shè)是關(guān)于總體特征的假設(shè)，檢驗方法是以統(tǒng)計量的抽樣分布為根據(jù)的，得到的結(jié)論是概率性的，不是絕對的肯定或否定，不等同于有或無生物學(xué)意義。對實驗結(jié)果作出科學(xué)的判斷和解釋，應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果、生物學(xué)知識和經(jīng)驗。一、毒理學(xué)試驗的統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計學(xué)觀點及方法在毒理學(xué)試驗的設(shè)計和結(jié)果評價中起關(guān)鍵的作用，毒理學(xué)試驗的發(fā)展也促進(jìn)了生物統(tǒng)計學(xué)的發(fā)展。毒理學(xué)試驗統(tǒng)計學(xué)評價的主要進(jìn)展是劑量—反應(yīng)關(guān)系研究和對超離差數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。 1. 毒理學(xué)試驗設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求 毒理學(xué)試驗的設(shè)計應(yīng)遵循隨機(jī)、重復(fù)及對照三個原則，要求各觀察值具有代表性，并且是相互獨立的。毒理學(xué)試驗的設(shè)計具體涉及到劑量水平數(shù)目及間隔，每個