【文章內容簡介】 第 5 頁 共 16 頁 四甲基乙二胺（ TEMED） 巰基乙醇 溴酚藍 蔗糖 國藥集團化學試劑有限公司 丙烯酰胺 （ Acr） N, N’亞甲雙丙烯酰胺 (Bis) AMRESCO 三羥甲基氨基甲烷（ Tris） 考馬斯亮藍 R250 國藥集團化學試劑有限公司 甘氨酸 ProteinMarker Mid Range Bio Basic Inc. 儀器 UV754 紫外可見光光度計 山東高密彩虹分析儀器有限公司 YP2020N 電子天平 上海科學精密有限公司 78— 1 加熱磁力攪拌器 常州國華電器有限公司 日立 CR22G 冷凍高速離心機 日本 HITACHI 公司 電熱恒溫干燥箱 連云港醫(yī)療器械設備廠 DYY— 2C 穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 南京 高新技術校園生物技術所 夾心式垂直板電泳槽 北京六一廠 微量注射器 上海安亭微量進樣廠 LD52A 低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠 SZ93 自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠 SHZD（Ⅲ ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠 DYB2 脫色搖床 江蘇省興化市分析儀器廠 PHS— 2F PH 計 上海精密科學儀器有限公司 ZGX— 300C 智能光照培養(yǎng)箱 杭州錢塘江設備有限公司制造 實驗 方法 考馬斯亮藍 G250 染色液制備 稱取 100mg 考馬斯 亮藍 G250 粉末，溶于 50mL 95％乙醇中，加入 85％（ W／ V）的磷酸 100mL，最后用蒸餾水定容到 1 000mL， 裝入試劑瓶中，此溶液在常溫下可放置一個月 [7]。 標準蛋白曲線的制作 用電子天平準確稱取標準牛血清白蛋白 20mg，放入燒杯中，用蒸餾水溶解后倒入 100mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至 100mL 刻度處，即制成標準蛋白溶液，濃度為 。 取干凈的具塞試管 6 支，按表 3 編號后，加入各種物質。并繪制 標準蛋白曲線 如圖 1 淮海工學院二○○六屆畢業(yè)設計（論文） 第 6 頁 共 16 頁 表 3標準曲線溶液配制 管號 對照 1 2 3 4 5 (ml) 0 蒸餾水 (ml) 0 加入的標準蛋白濃度 (mg/ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 3 3 A595nm 0 標準蛋白曲線 y = 4 . 7 2 1 4 x0 . 00 . 20 . 40 . 60 . 81 . 00 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5蛋白質濃度 / m g / m LA595 圖 1 標準牛血清白蛋白的吸光度與蛋白質濃度曲線 鹽藻胞外蛋白質的獲取與含量測定 (1)鹽藻生長培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進行。培養(yǎng)溫 度白天為 25℃，夜間 20℃。光照與黑暗的比為 12h： 12h。白天光照強度 35001x。培養(yǎng) 15d 后，進行 胞外蛋白質提取。 [9] (2)取六只三角燒瓶里培養(yǎng)的鹽藻倒入 1000 mL 的量筒中，量取 1000mL。 (3)將取得的藻液離心（ 4000r/min,20min）。取的上清液，置入 500 mL 的三角燒瓶中，放入冰箱上層待用。 (4) 將離心取得胞外蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍 G250 定量測蛋白質法 [7]。取干凈的具塞試管 4 支，按表 4 編號后，依次加入各種物質。 （ 5）利用 紫外可見光光度計 在 A595nm 下測得 1， 2， 3 組的吸光值，在標準曲線上找出相應的點，并求出鹽藻胞外蛋白質的濃度。 （ 6）從三角燒瓶中取得 200 mL 鹽藻上清液，置于燒杯中。從冰箱中取出預冷 24h 的丙酮，按與鹽藻上清液 1： 1 的體積緩慢加入 500mL 到燒杯中，并不斷用玻璃棒攪拌。然后將燒杯置于冰箱下層，沉淀蛋白質 [12]。 （ 7） 2h 后，從冰箱中取出燒杯。其中的溶液利用冷凍高速離心機離心（ 10000r/min,5min, 4 ℃） ，用 蒸餾水吹洗法 將取得的沉淀置于試管中，在冰箱下層保存待用。 淮海工學院二○○六屆畢業(yè)設計（論文） 第 7 頁 共 16 頁 表 4 鹽藻胞外蛋白質的含量測定 的溶液配制 管號 對照 1 2 3 蒸餾水 (ml) 0 0 0 蛋白溶液 (ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 鹽藻胞外蛋白質的 薄板層析與 Rf 值的測定 （ 1）用洗衣粉清洗玻璃板 4 12cm 和 15 cm 各兩塊，然后用蒸餾水沖洗，晾干待用。 （ 2）電子天平稱取 羧甲基纖維素鈉，放入 100mL 燒杯中，加入 25mL 蒸餾水，利用加熱磁力攪拌器攪拌均勻。待羧甲基纖維素鈉充分溶解后，再加入 14g 硅膠 G 粉，最后加入 25mL 蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，直至糊狀。 （ 3）將糊狀硅膠 G 粉注在玻璃板的一端，輕輕左右搖動，再上下擺動，并輕輕敲打左右兩端及底部，至上下左右均己均勻后，放在干凈、通風的水平工作臺上，自然干燥，即制成薄層層析板。 （ 4）將干燥的薄層層析板放入烘箱內 l10℃活化 15min 置于干燥器中保存?zhèn)溆?。 注意： 不能單用 硅膠 G 粉做支持物，否則風干后的硅膠板易破碎。 由于后面的電泳實驗需要對薄板上分離的蛋白質做定性分析，因此薄板的厚度要做的盡量厚一些，約 ～ 1mm。 （ 5）配制 6M 的 HCL：量取分析純 ,加蒸餾水定容至 10mL。 （ 6）從冰箱中取得制備的蛋白質沉淀，化凍，溶解。 （ 7）配制樣品溶液：從試管中量取 5mL 蛋白質溶液置于另一干凈的試管中，依次加入1ml95%的乙醇， 1 滴 6M 的 HCL，晃動均勻。 （ 8）配制層析液：按照正丁醇：冰醋酸：蒸餾水 4： 1： 1 的比例依次向燒杯加入正丁醇 20ml, 冰醋酸 5ml, 蒸餾水 5ml，攪拌均勻，并倒入層析缸中。 （ 9）從干燥器中取出 4 塊薄層層析板， 在薄層層析板下端距底邊 處用解剖針輕輕劃出一條線作為起始線 。 用毛細滴管吸取 配制樣品溶液 ，輕輕劃在起始線上， 待干后再劃一道，如此重復 10～ 20 次即可，劃線不可太粗，控制在 2mm 左右。 注意：每次所劃的樣不宜太多，要適宜均勻。 （ 10） 將點樣后的薄層板，置于裝有展開劑的展層缸中，每只缸裝兩塊薄層板，傾角15 度，嚴密封口，進行展開。展開時間為 3h50min 展開距離約達到薄層板的 3/4 時，取出薄層板。 將 薄層板 放在干凈、通風的水平工作臺上 30min,讓其自然干燥。 （ 11） 配 制 ％茚三酮 丙酮溶液：用電子天平稱取 水合 茚三酮 ，置于小燒杯中，然后向燒杯中加入 50mL 丙酮，用玻璃棒攪拌均勻。 （ 12）將顯色劑茚三 酮置于玻璃噴霧器中，均勻噴在展開后的層析板上。用吹風機將淮海工學院二○○六屆畢業(yè)設計（論文） 第 8 頁 共 16 頁 薄層板吹干后，將薄層板置于 105℃的烘箱中約 20 分鐘，薄層板上出現(xiàn)紫紅色的斑點。 （ 13）記下紫紅色斑點與所 劃線的距離記做 X， 層析液前沿 與所 劃線的距離記做 Y。遷移率 Rf=斑點中心與原點之間的距離記 /原點與溶劑前緣之間的距離。 （ 14）用刀片將紫紅色的斑點取下，置于試管中，加入 1mL 蒸餾水，搖勻，用離心機離心（ 4000r/min,10min） ,取上清液，保存與 EP 管中，待用。 鹽藻胞外蛋白質的 電泳與分子量測定 （ 1）配制 10%（ W/V） SDS 溶液： 用電子天平 稱 取 5gSDS 置于燒杯中 ，加重蒸水至 50mL，微熱使其溶解，置 于 試劑瓶中， 4℃ 貯存 ，待用 。 SDS 在低溫易析出結晶，用前微熱，使其完全溶解 。 （ 2） 配制 1%TEMED（ V/V）： 用移液槍取 1mLTEMED 注入燒杯中 ，加重蒸水至 100mL，攪拌均勻， 置 于 棕色瓶中， 4℃ 貯存 ，待用 。 （ 3）配制 10%AP（ W/V）： 用電子天平 稱 取 AP1g 置于燒杯中 ，加重蒸水至 10mL，攪拌均勻 。最好臨用前配制。 （ 4）配制 樣品溶解液：內含 1