【正文】 試劑用量 /ml 分離膠貯液 — 分離膠緩沖液 — 濃縮膠貯液 — 濃縮膠緩 沖液 — 10%SDS 1%TEMED 1 重蒸水 混勻后，置真空干燥器中，抽氣 10min 10%AP （ 15）處理樣品：取一 個 EP 管加入 200μ L 樣品溶解液，同時加入 200μ L 蛋白樣品溶液輕輕的蓋上蓋子，在 100℃沸水浴中保溫 3min， 同時以同樣的條件處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白， 取出搖勻， 冷卻后加樣，處理好的樣品暫時不用，可放在 — 20℃冰箱保存較長時間，使用前在100℃沸水中加熱 3min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合 。 （ 10） 配制 ： 稱考馬斯亮藍(lán) R250 ， 加35%的乙醇 454mL,46mL 冰乙酸混勻， 過濾后 待 用。L1 TrisHCl 緩沖液）： 用電子天平 稱 取三羥甲基氨基甲烷（ Tris） ， 置于燒杯中， 加少許重蒸水使其溶解，再加 1molL 1 TrisHCl 緩沖液。遷移率 Rf=斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)之間的距離記 /原點(diǎn)與溶劑前緣之間的距離。 注意：每次所劃的樣不宜太多，要適宜均勻。 注意： 不能單用 硅膠 G 粉做支持物，否則風(fēng)干后的硅膠板易破碎。然后將燒杯置于冰箱下層，沉淀蛋白質(zhì) [12]。 [9] (2)取六只三角燒瓶里培養(yǎng)的鹽藻倒入 1000 mL 的量筒中，量取 1000mL。 藥品 丙酮 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 考馬斯亮藍(lán) G250 粉末 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白粉末 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 85%磷酸 南京化學(xué)試劑有限公司 硅膠 GF254 中國雁蕩山試劑廠 羧甲基纖維素鈉 北京化學(xué)試劑有限公司 無水乙醇 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 分析純 AR 鹽酸 南京化學(xué)試劑一廠 正丁醇， 南京化學(xué)試劑一廠 冰醋酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 水合茚三酮 中國醫(yī)藥公司 十二烷基磺酸鈉 (SDS) 北京中聯(lián)化工試劑廠 重蒸水 實(shí)驗(yàn)室自制 過硫酸銨（ AP） AMRESCO 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計（論文） 第 5 頁 共 16 頁 四甲基乙二胺（ TEMED） 巰基乙醇 溴酚藍(lán) 蔗糖 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 丙烯酰胺 （ Acr） N, N’亞甲雙丙烯酰胺 (Bis) AMRESCO 三羥甲基氨基甲烷（ Tris） 考馬斯亮藍(lán) R250 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 甘氨酸 ProteinMarker Mid Range Bio Basic Inc. 儀器 UV754 紫外可見光光度計 山東高密彩虹分析儀器有限公司 YP2020N 電子天平 上?？茖W(xué)精密有限公司 78— 1 加熱磁力攪拌器 常州國華電器有限公司 日立 CR22G 冷凍高速離心機(jī) 日本 HITACHI 公司 電熱恒溫干燥箱 連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠 DYY— 2C 穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 南京 高新技術(shù)校園生物技術(shù)所 夾心式垂直板電泳槽 北京六一廠 微量注射器 上海安亭微量進(jìn)樣廠 LD52A 低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠 SZ93 自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠 SHZD（Ⅲ ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠 DYB2 脫色搖床 江蘇省興化市分析儀器廠 PHS— 2F PH 計 上海精密科學(xué)儀器有限公司 ZGX— 300C 智能光照培養(yǎng)箱 杭州錢塘江設(shè)備有限公司制造 實(shí)驗(yàn) 方法 考馬斯亮藍(lán) G250 染色液制備 稱取 100mg 考馬斯 亮藍(lán) G250 粉末，溶于 50mL 95％乙醇中，加入 85％（ W／ V）的磷酸 100mL，最后用蒸餾水定容到 1 000mL， 裝入試劑瓶中，此溶液在常溫下可放置一個月 [7]。但目前在國內(nèi)僅有少數(shù)幾家海藻加工企業(yè)，而主要是生產(chǎn)人類食品、藥品以及提取工業(yè)品，而至今尚無專門的海藻蛋白質(zhì)加工企業(yè)，對海藻蛋白質(zhì)研究正處于剛剛起步的階段。除去類胡蘿卜素和甘油后的藻渣中蛋白質(zhì)的含量比例將進(jìn)一步提高，達(dá)到 40%，其蛋白含量和氨基酸組成類似于大豆蛋白。但微藻細(xì)胞壁難于消化 ,食用后易產(chǎn)生不良副反應(yīng) ,食用前必須進(jìn)行充分的加工處理。外加脫落酸在適當(dāng)?shù)臐舛认拢? 也有這種功效。在該酶的催化下，異戊烯焦磷酸轉(zhuǎn)入β — 胡蘿卜素合成中的碳鏈。因此，近十幾年來科學(xué)家努力尋求一種能產(chǎn)生大量 β — 胡蘿卜素 的生物， 同時希望其中的順式異構(gòu)體越多越好，而鹽藻就是符合這一要求的最佳選擇。 表 1 鹽藻的營養(yǎng)成分 成分 蛋白質(zhì) 脂肪 總碳水化 合物 β — 胡蘿卜素 維生素 C 鈣 磷 含量（ %） 杜氏藻含有多種維生素，例如硫胺素、 吡哆醇、核黃素、菸酸，特別是生物素和 α 生育酚的含量較高。杜氏藻中對于 pH 的耐受性也有明顯不同，有耐受強(qiáng)酸性環(huán)境的種類，例如 D. acidophila， 也有耐 受 強(qiáng)堿性的種類 如 D． salina， 一般來說海生的杜氏藻并不是海洋浮游植物的主要種類，但在超鹽環(huán)境中，如美國的大鹽湖、以色列的死海、澳大利亞的賓克湖中，紅色的 D. salina， 粉紅色的 D. parva， 綠色的 D. viridis 常常是優(yōu)勢種。 杜氏藻的分布及生態(tài) 杜氏藻廣泛存在于自然界，既有淡水種類，例如 D. flagellata， D. chordata， D. laleralis，D. paupera。細(xì)胞內(nèi)有 1 個杯狀葉綠體，底基部有 1 個由多糖顆粒包圍的蛋白核廣多糖 ， 是細(xì)胞的貯藏產(chǎn)物，此外還有核、線粒體、高爾基體、液泡和眼點(diǎn)。 利用考馬斯亮藍(lán) G— 250 染色法 在 595nm下測定吸光值， 得到 鹽藻 胞外蛋白質(zhì)的含量為 。在不同條件下，可觀察到卵形、球形、圓柱形、橢圓形、梨形、紡錘形等?？梢姸攀显迥褪茺}濃度變化范圍很寬。杜氏藻的自然群體有明顯的季節(jié)變化，在 夏季時 當(dāng)水溫超過 30℃ 時，自然群體最為豐富，但它們在水中并不是均勻分布的，通常 和 D. parva 集中于水體表層，而綠色杜氏藻 (D. viridis)常在水體的下層和底泥表面。 鹽藻的 研究現(xiàn)狀 隨著人們對β — 胡 蘿卜素功效的認(rèn)識日益深入，對有關(guān)鹽藻累積β — 胡蘿卜素的研究也逐步加深。有關(guān)β — 胡蘿卜素的累積機(jī)制，特別是異構(gòu)化位置的研究，倍受關(guān)注。決定形成的雙鍵是 Z 型還是 E 型， 從而決定以后 — 異構(gòu)體的構(gòu)型。介質(zhì)中的營養(yǎng)鹽與β — 胡蘿卜素的合成也有關(guān)系。由于魚和海鮮的消費(fèi)量越來越大 ， 微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的利用具有新的潛力。蛋白質(zhì)含量高達(dá) 50％左右 (干粉 )，相當(dāng)于全脂奶粉的 2 倍 [3]。應(yīng)用酶解 工 藝是今后發(fā)展海藻飼料業(yè)的一種很有希望的加工工藝，還有待于繼續(xù)深入研究，開發(fā)更好的提取方法。并繪制 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線 如圖 1 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計（論文） 第 6 頁 共 16 頁 表 3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制 管號 對照 1 2 3 4 5 (ml) 0 蒸餾水 (ml) 0 加入的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度 (mg/ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 3 3 A595nm 0 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線 y = 4 . 7 2 1 4 x0 . 00 . 20 . 40 . 60 . 81 . 00 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5蛋白質(zhì)濃度 / m g / m LA595 圖 1 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白的吸光度與蛋白質(zhì)濃度曲線 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的獲取與含量測定 (1)鹽藻生長培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。 (4) 將離心取得胞外蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán) G250 定量測蛋白質(zhì)法 [7]。 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計（論文） 第 7 頁 共 16 頁 表 4 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的含量測定 的溶液配制 管號 對照 1 2 3 蒸餾水