【文章內(nèi)容簡介】 究員，衛(wèi)生部比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 冷啟彬，研究員，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所 劉海鷹，副研 究員，病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 劉映樂，副教授，病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 雷曉波，助理研究員，病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)費(fèi)比例： %。 課題 4：腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究 主要研究內(nèi)容： （ 1）腦膜炎奈瑟菌變異與流行規(guī)律研究 研究我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律，研究不同血清群菌株之間莢膜合成基因簇的表達(dá)、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移以及基因重組的調(diào)控機(jī)制。研究我國主要流腦流行菌株的粘附定植能力和相關(guān)毒力基因、蛋白的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以期了解我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對(duì)菌株的擴(kuò)散以 及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；研究我國流腦菌侵襲力及相關(guān)基因蛋白特征，以期了解細(xì)菌的粘附和侵襲毒力基因與白的相互關(guān)系；研究我國流腦菌株的變異規(guī)律。 （ 3）腦膜炎奈瑟菌變異與致病機(jī)制關(guān)系研究 選擇不同血清群、不同年代、不同基因型別的流腦菌代表菌株，進(jìn)行體外粘附試驗(yàn)，比較不同流腦菌的粘附定植能力；分析我國流腦菌代表菌株流行變異規(guī)律和細(xì)菌在健康人群中定植傳播能力的關(guān)聯(lián)性；選擇與流腦菌粘附相關(guān)的因子編碼基因作為目的靶基因，進(jìn)行序列測(cè)定分析，同時(shí)采用逆轉(zhuǎn)錄 PCR、熒光定量PCR 和 RNA 測(cè)序等技術(shù)手段進(jìn)行粘附因子相關(guān)的關(guān) 鍵基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，研究粘附因子在不同流腦菌中的基因序列、轉(zhuǎn)錄水平、調(diào)控水平上的差異；進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞相互作用實(shí)驗(yàn)，研究不同流腦菌在侵襲力的差異性；通過序列測(cè)定檢測(cè)莢膜相關(guān)基因序列上的差異，利用逆轉(zhuǎn)錄 PCR、熒光定量 PCR 和 RNA 測(cè)序等技術(shù)手段檢測(cè)莢膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并進(jìn)一步探索莢膜基因序列和轉(zhuǎn)錄水平的差異與其侵襲能力的可能關(guān)系；以小 RNA 為切入點(diǎn)，選擇部分腦膜炎奈瑟菌毒力相關(guān)基因（包括粘附定植、侵襲和抗吞噬等相關(guān)基因），采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、RNA 測(cè)序、 DNA 微陣列、逆轉(zhuǎn)錄 PCR、 Northern 雜交等技 術(shù)開展調(diào)控機(jī)制探索性研究。收集和選擇一定數(shù)量的中國流腦菌臨床菌株，利用新一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高通量序列分析，利用生物信息學(xué)技術(shù)手段尋找變異，并分析其規(guī)律。 課題目標(biāo)： （ 1）掌握我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律； （ 2）了解我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對(duì)菌株的擴(kuò)散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義； （ 3）了解細(xì)菌的粘附和侵襲毒力基因與蛋白的相互關(guān)系； （ 4）培養(yǎng)中青年研究骨干 810 人，博士后、研究生 1520 名； （ 5）在 SCI 收錄雜志上發(fā)表論文 20 篇以上。 承擔(dān)單位： 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù) 防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 課題負(fù)責(zé)人：金奇，研究員，病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 主要學(xué)術(shù)骨干： 邵祝軍，研究員， 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 王千秋，研究員，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所 張笑冰，副研究員，病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 彭俊平，副研究員，病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)費(fèi)比例： %。 四、年度計(jì)劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 誘導(dǎo)、分離和鑒定志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體；對(duì)志賀 菌小 RNA 進(jìn)行預(yù)測(cè)和統(tǒng)計(jì)，并 對(duì)預(yù)測(cè)的小 RNA 進(jìn)行初步驗(yàn)證；分析福氏志賀氏菌 1b和 2b的全基因組序列，尋找并驗(yàn)證負(fù)責(zé) O 抗原側(cè)鏈修飾的噬菌體和關(guān)鍵基因 。 驅(qū)除不同亞群和不同血清型志賀氏菌菌株中的毒力大質(zhì)粒，獲得含有志賀氏菌毒力大質(zhì)粒的大腸桿菌，進(jìn)行志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達(dá)譜差異分析； 比較不同 EV71 毒株的細(xì)胞和動(dòng)物感染特性，構(gòu)建中國 EV71 主要流行株的感染性克隆，找出具有代表性突變序列，對(duì) EV71 感染主要器官特別是神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞系進(jìn)行EV71 細(xì)胞受體的表達(dá)譜分析，構(gòu)建EV71 亞基因組 復(fù)制子； 構(gòu)建成年小鼠和恒河猴等 EV71感染動(dòng)物模型，建立 EV71 病毒經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染模型和體外血腦屏障模型，描述經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)譜變化，比較不同的基因型和流行株 誘導(dǎo)、分離到至少 3 種血清型轉(zhuǎn)換噬菌體，建立福氏志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體庫；初步獲得志賀菌的小RNA 庫，完成福氏志賀氏菌 1b 和2b 的全基因組序列，證明 O 抗原側(cè)鏈修飾基因功能；初步完成志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達(dá)譜差異分析； 完成對(duì)不同地區(qū) EV71 分離株的序列分析測(cè)定，闡明其在細(xì)胞和動(dòng)物上的感染特性，確立代表性突變序列 , 構(gòu)建我國 EV71 主要流行株（亞型）感染性克隆，獲得 EV71 細(xì)胞受體在多組織來源的細(xì)胞系中的表達(dá)譜。 初步建立用于 EV71 感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和 恒河猴模型等，初步揭示不同類型病人細(xì)胞因子等表達(dá)譜、免疫調(diào)制特征和機(jī)制； 完成 500 株流腦菌株 DNA 的提取和 PFGE、 MLST 分型分析 , 建立23 種細(xì)菌宿主細(xì)胞粘附相互作用細(xì)胞模型 , 建立莢膜基因簇相關(guān)基因檢測(cè)和差異性分析技術(shù) , 完成代表 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 的感染及神經(jīng)毒力差異，篩選能阻斷病毒復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白； 對(duì)我國不同年代、不同血清群流腦菌株進(jìn)行 PFGE、 MLST 分子分型和種群結(jié)構(gòu)分析，篩選有代表性的菌株，建立細(xì)菌 宿主細(xì)胞粘附相互作用技術(shù)方法以及莢膜相關(guān)基因序列差異性檢測(cè)技術(shù)；進(jìn)行小 RNA篩選； 獲得研究所需菌毒種及樣本資源，進(jìn)行分析并建立信息數(shù) 據(jù)庫。 株 RNA 測(cè)序； 初步完成有關(guān)菌毒株的收集工作； 發(fā)表 SCI 論文 810 篇。 第 二 年 對(duì)獲得的血清型相關(guān)噬菌體進(jìn)行基因組序列測(cè)定和鑒定，比較其與非優(yōu)勢(shì)血清型相關(guān)噬菌體的特征差異，尋找噬菌體基因組上優(yōu)勢(shì)決定基因或區(qū)域；對(duì)篩選出小 RNA 進(jìn)一步進(jìn)行鑒定分 析，對(duì)多個(gè)毒力大質(zhì)粒編碼的小 RNA 進(jìn)行功能探討；篩選對(duì)志賀菌生長有明顯抑制作用的藥物；設(shè)計(jì)構(gòu)建志賀菌全基因組芯片；測(cè)定福氏志賀氏菌 3a、 4b 的全基因組序列，尋找并驗(yàn)證負(fù)責(zé) O 抗原側(cè)鏈修飾的噬菌體和關(guān)鍵基因 。 解析不同福氏志賀氏菌血清型的分化機(jī)制和不同血清型之間轉(zhuǎn)化的變異機(jī)制；建立針對(duì)全部福氏志賀氏菌血清亞型的分 初步確定噬菌體基因組上優(yōu)勢(shì)決定基因或區(qū)域，初步了解志賀菌小RNA 的生物學(xué)功能以及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制；完成福氏志賀氏菌 3a 和 4b的全基因組序列，證明 O 抗原側(cè)鏈修飾基因功能；建立福氏志賀氏菌血清亞型的分子分型方法，初步解析不同福氏志賀氏菌血清型的分化機(jī)制和不同血清型之間轉(zhuǎn)化的變異機(jī)制；揭示志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后以及大腸桿菌獲得毒力大質(zhì)粒前后在不同培養(yǎng)條件下的蛋白表達(dá)譜差異 。 闡明 EV71 病毒的 VP1 編碼基因序列變異特征，以及重組 EV71 病毒 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 子分型方法；分析志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達(dá)譜差異以及大腸桿菌獲得毒力大質(zhì)粒前后在不同培養(yǎng)條件下的蛋白表達(dá)譜差異，篩選差異表達(dá)蛋白蛋； 進(jìn)行 EV71 VP1 的變異分析，分析不同重組突變病毒在 細(xì)胞水平上的感染特性，開展不同 EV71 突變株3C、 3C 與宿主結(jié)合因子以及 3C 和抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，探討 EV71（或結(jié)構(gòu)蛋白）與細(xì)胞受體相互作用的機(jī)制； 建立完善 EV71 感染動(dòng)物模型，篩選與 EV71 蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞性因子或靶分子，分析不同類型病人的細(xì)胞因子等表達(dá)差異以及對(duì)天然免疫的拮抗作用； 完善細(xì)菌宿主粘附能力檢測(cè)技術(shù)和莢膜基因簇相關(guān)基因序列差異性檢測(cè)技術(shù)，對(duì)不同群代表性的菌株進(jìn)行粘附定植能力差異性、莢膜基因簇差異性和粘附相關(guān)基因進(jìn)行分析，建立粘附因子相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)技術(shù)，繼 續(xù)進(jìn)行小 RNA 分析。 在不同細(xì)胞上的感染特性，獲得 3C蛋白晶體 結(jié)構(gòu)或 3C/抑制劑復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，初步揭示 EV71 與受體相互作用的分子機(jī)制 。 完善用于 EV71 感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等，初步揭示不同病人細(xì)胞因子等表達(dá)特征和干擾素拮抗機(jī)制； 闡明不同群流腦菌株對(duì)宿主細(xì)胞粘附力檢測(cè)，完成莢膜基因簇差異性分析和相關(guān)粘附基因的分析，對(duì)候選小 RNA 進(jìn)行鑒定； 發(fā)表 SCI 論文 1015 篇。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 分析血清型轉(zhuǎn)換噬菌體感染及轉(zhuǎn)換志賀菌血清型別的可能性、特異性及感染時(shí)序以及其整合位點(diǎn)與多噬菌體 DNA在宿主菌基因組上排列方式，描 繪福氏志賀菌血清型間轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律；構(gòu)建 35 種抗菌藥物作用下志賀氏菌構(gòu)建轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)庫，完成志賀菌耐藥株和敏感株基因組結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組的差異分析，著重分析志賀菌獲得耐藥性的分子機(jī)理；選擇 4株位于不同進(jìn)化位置的志賀氏菌進(jìn)行全基因組測(cè)序；分析菌株的蛋白復(fù)合物表達(dá)差異以及菌株間轉(zhuǎn)錄譜的差異； 對(duì)來自不同年代，具有基因差異和地理分布特點(diǎn)的代表株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定；分析不同重組突變EV71在動(dòng)物體內(nèi)感染特性及其對(duì)宿主免疫系統(tǒng)影響與病理損害特征；進(jìn)行不同突變 3D 蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究；研究病毒非編碼區(qū)與病毒蛋白和宿主蛋白 的相互作用及其對(duì) RNA復(fù)制的影響； 對(duì)新發(fā)現(xiàn)的 EV71 入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)作用因子進(jìn)行動(dòng)物水平的系統(tǒng)研究，有針對(duì)性的比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異；揭示病毒感染機(jī)體后免疫應(yīng)答的 掌握噬菌體感染及轉(zhuǎn)換宿主志賀菌血清型別 的特異性和時(shí)序性，完整描繪福氏痢疾桿菌血清型別轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律，闡明噬菌體在宿主菌基因組上整合位點(diǎn)及排列方式；初步了解志賀氏菌的潛在耐藥機(jī)制，篩選出若干新的候選藥物靶標(biāo)；完成 4 株志賀菌的全基因組測(cè)序分析，闡明毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后志賀菌株蛋白復(fù)合物表達(dá)差異及轉(zhuǎn)錄譜差異； 在全基因組水平闡明 EV71 代表株的遺傳變異特征；闡明不同重組病毒的體內(nèi)感染特性，包括宿主免疫和病理反應(yīng)；獲得 3D 或 3CD 與抑制劑復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及 3CD與 RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)；部分闡明 EV71 在神經(jīng)細(xì)胞復(fù)制中的參與的病毒及宿主蛋白； 揭示 EV71 侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制，進(jìn)一步揭示 EV71 免疫調(diào)制和保護(hù)機(jī)制； 闡明 100 株 W135 群、 Y 群、不可分群等流腦菌株宿主細(xì)胞粘附力差異，完成菌株粘附相關(guān)基因分析，構(gòu)建突變體進(jìn)行功能研究； 發(fā)表 SCI 論文 1520 篇。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 動(dòng)態(tài)，研究重要免疫細(xì)胞與病情發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的功能關(guān)聯(lián)性及EV71 對(duì)天然免疫的拮抗機(jī)制。 分析 W135 群、 Y 群、不可分群等其它血清群流腦菌株的粘附定植能力差異、莢膜基因簇差異和粘附定植相關(guān)基因，對(duì)代表性菌株進(jìn)行粘附因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，選擇 2個(gè)小 RNA 進(jìn)行功能分析。 第 四 年 分析噬菌體對(duì)志賀菌毒力基因表達(dá)的影響；分析和驗(yàn)證志賀菌耐藥機(jī)制和調(diào)控機(jī)理；篩選志賀菌參與調(diào)控宿主免疫反應(yīng)的重要功能蛋白或毒力蛋白及其相互作用的蛋白和區(qū)域；選擇 4 株與不同志賀氏菌進(jìn)化簇關(guān)系較近的 EIEC菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，分析不同志賀氏菌分化的主要?jiǎng)恿彤a(chǎn)生的結(jié) 果，尋找在志賀氏菌形成過程中的關(guān)鍵基因上的 SNP 改變，分析志賀氏菌與 EIEC 菌株之間的進(jìn)化關(guān)系和差異，系統(tǒng)解析志賀氏菌的進(jìn)化起源機(jī)制；綜合分析并驗(yàn)證上述比較蛋白質(zhì)組和比較轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，并分析相關(guān)基因的受調(diào)控水平；驗(yàn)證差異表達(dá)復(fù)合物各組成亞基間的相互作用。 探討我國 EV71 等病毒基因變異和神經(jīng)毒性的關(guān)系，闡明不同毒株在 初步掌握不同噬菌體對(duì)志賀菌致病力和毒力的 影響，了解福氏志賀菌優(yōu)勢(shì)血清型菌株的致病力特點(diǎn)；初步掌握志賀菌重點(diǎn)耐藥相關(guān)基因的調(diào)控功能；獲得志賀菌重要功能蛋白在宿主細(xì)胞中的靶蛋白并初步了解相應(yīng)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能；初步了解志賀菌進(jìn)化的動(dòng)力、其形成過程中關(guān)鍵基因的變異、與 EIEC 菌株之間的進(jìn)化關(guān)系以及進(jìn)化起源機(jī)制；確定毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后志賀菌株差異蛋白相關(guān)基因的受調(diào)控水平以及差異表達(dá)復(fù)合物各組成亞基間的相互作用； 揭示我國大陸流行的 EV71 病毒的型別特點(diǎn)、進(jìn)化特征及其與國外不同年代毒株的差別；初步確定 EV71神經(jīng)毒性相關(guān)蛋白；獲得 EV 71 2A、2B、 2C、 3A 及突變蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué) 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 不同基因之間的進(jìn)化關(guān)系和病毒衍化來源，并對(duì) EV71 病毒的重組進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析；進(jìn)行神經(jīng)毒性相關(guān)蛋白的篩選；進(jìn)行不同突變 EV71 2A、 2B、2C 和 3A 蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究；分析 EV71 和脊髓灰質(zhì) 炎來源 IRES對(duì)翻譯效率的影響；鑒定參與病毒基因組翻譯的