【文章內(nèi)容簡介】 Wenen LIU 結(jié)核夾層杯技術 結(jié)核感染 T細胞檢測技術 分子生物學技術 結(jié)核分枝桿菌的快速診斷 39 Wenen LIU 結(jié)核夾層杯技術 ? 原理 ：通過專用消化滅活液消化組織細胞和粘蛋白等，將結(jié)核桿菌裸露出來，并結(jié)合高速震蕩，使痰標本充分液化而有利于其中的抗酸桿菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夾層杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片針頂出內(nèi)底，經(jīng)封片等步驟后，鏡下檢測抗酸桿菌。 40 Wenen LIU 檢測流程示意圖 41 Wenen LIU 鏡下比較 圖 2. 夾層杯法（新方法）： 菌量多，背景清晰，易于觀察 圖 1. 直接涂片法（傳統(tǒng)方法）：菌量少，背景不清晰 42 Wenen LIU 夾層杯診斷技術的優(yōu)點 陽性率高 背景清晰，易于觀察 易于標準化 檢測速度快 生物安全性好 夾層杯診斷 技術的優(yōu)點 43 Wenen LIU 結(jié)核夾層杯技術 標本要求： （ 1） 痰液要求新鮮，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰時，患者以清水漱口３次，然后用力咳出氣管深處的痰 （ 2）用氫氧化鈉處理完全。 臨床應用：用于結(jié)核分枝桿菌的初篩 44 Wenen LIU 結(jié)核感染 T細胞檢測技術 ? 是以 ELISPOT技術 檢測結(jié)核感染的新方法 ， ELISPOT是近 20 年發(fā)展起來的檢測抗原特異性 T細胞的技術，是目前最敏感的檢測抗原特異性 T細胞的方法之一。 45 Wenen LIU 原 理 ? 結(jié)核感染的免疫應答反應以細胞免疫為主，作為免疫應答的一部分， T細胞受結(jié)核抗原刺激致敏，形成活化的效應 T細胞，包括CD4和 CD8。 ? 結(jié)核桿菌感染者外周血單核細胞中存在結(jié)核特異的活化 T淋巴細胞，這些淋巴細胞在體外再次受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌 γ 干擾素， 通過 檢測 體外分泌的 IFNγ 來診斷是否存在結(jié)核感染 。 46 Wenen LIU 活動性結(jié)核與潛伏感染 接觸活動性結(jié)核病患者 暴露程度不足，結(jié)核桿菌被機體免疫力清除 沒有癥狀 ,結(jié)核桿菌仍舊存在而不能被發(fā)現(xiàn) X光 / CT 掃描顯示正常 沒有抗體應答 診斷困難 傳統(tǒng)的結(jié)核感染檢測只有 TST（ PPD） 機體被感染 受機體免疫力抑制 沒有臨床癥狀 終身處于感染狀態(tài) 潛伏感染 有臨床癥狀 具有傳染性 結(jié)核桿菌可以通過涂片、培養(yǎng)檢測出 胸部的 X光或 CT 掃描顯示異常 肺外結(jié)核難以診斷 (特別是兒童 ) 活動性結(jié)核 5% 5% 再次激活 47 Wenen LIU 活動性結(jié)核與潛伏感染 ? 新發(fā) TB病例來自潛伏性結(jié)核感染人群 ? 潛伏性結(jié)核感染（ hidden epidemic）人群數(shù)量巨大 —— “ 定時炸彈 ” ? 若想控制活動性 TB，必須先控制潛伏性結(jié)核感染 – 鑒別高危人群 – 預防性治療 – 免疫接種 活動性 TB – 每年 900萬新發(fā)病例 僅為冰山一角 Latent TB “hidden epidemic” 2 billion people infected 48 Wenen LIU 結(jié)核感染 T細胞檢測 49 Wenen LIU ? γ 干擾素釋放實驗 （ IGRA， interferon gamma release assay） ? 酶聯(lián)免疫斑點技術 （ ELISPOT， EnzymeLinked ImmunoSpot assay） ? 結(jié)核桿菌特異抗原 早期抗原靶 6（ ESAT6） early secreted antigenic target 6 培養(yǎng)濾液蛋白 10（ CFP 10） culture filtrate protein 10 ） 技 術 背 景 50 Wenen LIU ? 結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應 T淋巴細胞，效應 T淋巴細胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（ IFNγ ）。因此，檢測效應 T淋巴細胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。 ? 由于效應 T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀。 ? 基于 IGRA原理的檢測項目目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中 γ 干擾素釋放實驗（ IGRA） 51 Wenen LIU 酶聯(lián)免疫斑點技術（ ELISPOT） 52 Wenen LIU 酶聯(lián)免疫斑點技術（ ELISPOT） ? 近二十多年來，隨著技術改良， ELISPOT 分析技術已經(jīng)是當世公認的 最靈敏 的抗原特定T細胞的體外檢測技術 ? 結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術與酶聯(lián)免疫吸附技術（即 ELISA 技術），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況， 靈敏度高 。 ? 其技術原理，可一句話概括為：用抗體捕獲培養(yǎng)中細胞所分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色方式將其表現(xiàn)出來（ Sedgwick JD 2023）。 53 Wenen LIU 結(jié)核桿菌特異抗原 ESAT6與 CFP10抗原 由結(jié)核桿菌基因組 RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白 所有的卡介苗（ BCG）均丟失該基因序列 絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在 RD1區(qū) 54 Wenen LIU 操作步驟 ① ② 55 Wenen LIU 操作步驟 ⑤ ⑥ ④ 孵育 1小時 56 Wenen LIU 實 際 效 果 圖 陰性結(jié)果 陽性結(jié)果 空白對照 抗原 A ESAT6 抗原 B CFP10 陽性對照 （ PHA） 57 Wenen LIU 特點 ? 特異性好，不受卡介苗（ BCG）接種和環(huán)境分枝桿菌影響 ? 靈敏度高，在免疫力低下 /受抑制人群中有很高的檢出率 ? 快速， 24小時報告結(jié)果 58 Wenen LIU 寫入診療指南的國家（ Guidelin