【正文】 病毒的 VP1 編碼基因序列變異特征，以及重組 EV71 病毒 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 子分型方法；分析志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達譜差異以及大腸桿菌獲得毒力大質(zhì)粒前后在不同培養(yǎng)條件下的蛋白表達譜差異，篩選差異表達蛋白蛋； 進行 EV71 VP1 的變異分析，分析不同重組突變病毒在 細胞水平上的感染特性，開展不同 EV71 突變株3C、 3C 與宿主結(jié)合因子以及 3C 和抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，探討 EV71（或結(jié)構(gòu)蛋白）與細胞受體相互作用的機制； 建立完善 EV71 感染動物模型，篩選與 EV71 蛋白質(zhì)相互作用的細胞性因子或靶分子，分析不同類型病人的細胞因子等表達差異以及對天然免疫的拮抗作用； 完善細菌宿主粘附能力檢測技術(shù)和莢膜基因簇相關(guān)基因序列差異性檢測技術(shù)，對不同群代表性的菌株進行粘附定植能力差異性、莢膜基因簇差異性和粘附相關(guān)基因進行分析，建立粘附因子相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平檢測技術(shù)，繼 續(xù)進行小 RNA 分析。 初步建立用于 EV71 感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和 恒河猴模型等，初步揭示不同類型病人細胞因子等表達譜、免疫調(diào)制特征和機制； 完成 500 株流腦菌株 DNA 的提取和 PFGE、 MLST 分型分析 , 建立23 種細菌宿主細胞粘附相互作用細胞模型 , 建立莢膜基因簇相關(guān)基因檢測和差異性分析技術(shù) , 完成代表 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 的感染及神經(jīng)毒力差異，篩選能阻斷病毒復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點蛋白； 對我國不同年代、不同血清群流腦菌株進行 PFGE、 MLST 分子分型和種群結(jié)構(gòu)分析，篩選有代表性的菌株，建立細菌 宿主細胞粘附相互作用技術(shù)方法以及莢膜相關(guān)基因序列差異性檢測技術(shù)；進行小 RNA篩選； 獲得研究所需菌毒種及樣本資源，進行分析并建立信息數(shù) 據(jù)庫。 課題目標(biāo)： （ 1）掌握我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律； （ 2）了解我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義； （ 3）了解細菌的粘附和侵襲毒力基因與蛋白的相互關(guān)系； （ 4）培養(yǎng)中青年研究骨干 810 人，博士后、研究生 1520 名； （ 5）在 SCI 收錄雜志上發(fā)表論文 20 篇以上。 課題 4：腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機制研究 主要研究內(nèi)容： （ 1）腦膜炎奈瑟菌變異與流行規(guī)律研究 研究我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律，研究不同血清群菌株之間莢膜合成基因簇的表達、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移以及基因重組的調(diào)控機制。 課題 3： EV71 等病毒致病與免疫機制研究 主要研究內(nèi)容： （ 1） EV71 等病毒致病機制研究 建立成年小鼠、恒河猴、轉(zhuǎn)基因小鼠等 EV71 感染動物模型；建立 EV71 病毒經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染模型和體外血腦屏障模型，利用基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)檢測 比較單純經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)同正常小鼠的腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和周細胞表達譜差異，比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異，篩選能阻斷病毒復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點蛋白；建立血腦屏障結(jié)構(gòu)細胞（腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、周細胞）和神經(jīng)軸突細胞、脊髓細胞、骨骼肌細胞的 cDNA 文庫及差異文庫，利用篩選與 EV71 蛋白質(zhì)相互作用的細胞因子或靶分子；利用轉(zhuǎn)基因或基因敲除技術(shù)對新發(fā)現(xiàn)的 EV71 入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)作用因子進行動物水平的系統(tǒng)研究，有針對性的比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異；闡明 Toll 樣受體對 EV71 病毒的識別機制及病毒編碼產(chǎn)物對干擾素激活抑制機制，探討天然免疫抑制與病毒致病機制的關(guān)系。 （ 2） EV71 變異與病毒毒力關(guān)系研究 對不同地區(qū) EV71分離株體外細胞感染和體內(nèi)動物感染的不同特性進行分析比較，通過構(gòu)建一系列的突變重組病毒，鑒定影響 EV71 神經(jīng)毒力的關(guān)鍵位點。同時，通過生物信息學(xué)分析與分子生物學(xué)實驗相結(jié)合的手段，在前期小 RNA 相關(guān)工作的基礎(chǔ)之上開展毒力大質(zhì)粒上小RNA 的功能研究。針對 Ⅲ 型分泌系統(tǒng)釋放的毒力蛋白在志賀氏菌感染中能下調(diào)宿主免疫應(yīng)答的現(xiàn)象，尋找其在宿主細胞中的作用靶點，研究毒力相關(guān)蛋白和其它重要功能蛋白參與調(diào)控宿主相關(guān)免疫信號途徑的新作用方式，以幫助我們理解志賀氏菌的致病機制，為進一步研發(fā)抗痢疾小分子藥物提供理論基礎(chǔ)和線索。 （ 3）志賀氏菌毒力大質(zhì)粒和染色體的協(xié)同進化及調(diào)控 毒力大質(zhì)粒的獲得是志賀氏菌從非致病性大腸桿菌變?yōu)橹虏【牡谝徊揭彩亲钪匾囊徊?，隨后志賀氏菌的染色體與大 質(zhì)粒就開始了漫長的協(xié)同進化歷程，以達到其適應(yīng)腸道新環(huán)境的最佳狀態(tài)。 課題 1：志賀氏菌變異規(guī)律和致病機制研究 主要研究內(nèi)容： （ 1）志賀氏菌 O 抗原的變異規(guī)律的研究 通過對不同福氏志賀氏菌血清型亞型的全基因組分析，找到負責(zé)特定血清型亞型形成的關(guān)鍵基因。圍繞項目的科學(xué)問題、主要研究內(nèi)容和目標(biāo)，擬設(shè)置 “志賀氏菌變異規(guī)律和致病機制研究 ”、 “EV71 等病毒變異與毒力關(guān)系的研究 ”、 “EV71 等病毒致病與免疫機制研究 ”和 “腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機制研究 ”四個課題。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所建立了基因工程動物模型技術(shù)平臺、醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所建立了靈長類動物平臺，均可為本項目的開展提供支撐。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物研究所、中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所等單位分離、收集了 EV71 毒株 600 余株，研究單位和北京地壇醫(yī)院以及多個省級疾控中心建立了良好合作關(guān)系，可獲得研究所需臨床樣本，另外研究所需的細胞株、克隆、細胞系、抗體等均已收集齊備；中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所呼吸道病原保存有近 50 年來的不同時期的流腦菌株和樣本，保存有我國自 1956 年以來腦膜炎奈瑟菌菌株 3000 多株，這些菌株能夠代表建國以來我國流腦流行期間以及流行間期腦膜炎奈瑟菌菌株的整體狀況。國際上的研究各有側(cè)重。研究內(nèi)容系統(tǒng)全面，包括 EV71 遺傳變異特征、變異與毒力關(guān)系、復(fù)制機制、神經(jīng)嗜性機制、免疫調(diào)制機制、疫苗保護機制和動物模型等，涵蓋了病毒學(xué)、免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、病理學(xué)等諸多領(lǐng)域，是迄今為止最為全面的研究，填補多方面空白。我國志賀氏菌研究團隊，多年來一直開展福氏志賀氏菌的研究， 在基因組解析、進化理論、 O 抗原多樣性形成機制解析、新的血清型發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)組分析等方面， 達到國際水平。 充分利用我國腦膜炎奈瑟菌資源，研究不同來 源菌株流行變異規(guī)律及粘附侵襲相關(guān)基因蛋白調(diào)控機制。 （三）創(chuàng)新性 本項目以志賀氏菌、 EV71 等腸道病毒和腦膜炎奈瑟菌等為研究對象，開展系統(tǒng)研究，具有很強的創(chuàng)新性： 從血清型轉(zhuǎn)換噬菌體入手，研究噬菌體感染的特異性和時序性，揭示噬菌體與福氏志賀菌血清變遷的關(guān)系，對于預(yù)測、預(yù)警流行血清型及血清型變化趨勢，闡明細菌性痢疾的流行規(guī)律具有重要意義。 EV71 等病毒致病與免疫保護機制研究 （ 1） EV71 等致病機制研究：建立血腦屏障模型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、動物學(xué)等技術(shù)體系，進行血腦屏障侵入路線同神經(jīng)軸突侵入路線的功能性比較研究、篩選和鑒 定參與不同 EV71入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)路線的相關(guān)作用因子，揭示神經(jīng)毒性分子機制研究，從而闡明 EV71 的神經(jīng)嗜性機制。 （ 2） EV71 等病毒變異與病毒毒力關(guān)系研究：通過對不同地區(qū)、不同毒力的EV71 分離株進行序列比對，利用定點突變技術(shù)，在 EV71 基因組中引入突變位點，轉(zhuǎn)錄出 RNA 后轉(zhuǎn)染敏感宿主細胞，觀察重組病毒的產(chǎn)生效率和噬斑形成能力等，確定 EV71 變異與毒力的關(guān)系，并在動物模型上進一步驗證。 （二）技術(shù)路線 志賀氏菌變異規(guī)律和致病機制研究 本課題將收集和分離志賀氏菌流行株，分析其血清型、耐藥性、生化特性、毒力等，選擇具有代表性菌株，通過全基因序列分析以及比較基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)不同血清型、耐藥性、毒力及生化特性等菌株的基因組差異，重點研究各種志賀氏菌菌株之間致病性質(zhì)粒、毒力島、血清型轉(zhuǎn)換噬菌體等可水平轉(zhuǎn)移遺傳成分以及與生存環(huán)境相關(guān)的代謝基因間的差異，并進一步通過噬菌體分離、基因敲除、基因?qū)搿游锒玖υu價等分析上述差異與致病力的關(guān)系，同時開展志賀氏菌致病性質(zhì) 粒與染色體的協(xié)同進化研究、重要毒力蛋白和復(fù)合物與宿主相互作用，系統(tǒng)解析志賀氏菌的變異規(guī)律與致病性的關(guān)系。 在 SCI 收錄雜志上發(fā)表論文 80100 篇。包括揭示 EV71 侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機制；部分闡明 EV71 拮抗天然免疫、誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的機制及其與 EV71 及疾病進展、預(yù)后的關(guān)系，提出 EV71 滅活疫苗的免疫保護機制和有效性評價指標(biāo)；建立完善用于 EV71 感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等。 五年預(yù)期目標(biāo) 深入揭示志賀氏菌變異規(guī)律和致病機制。通過課題的實施，培養(yǎng)一批優(yōu)秀人才，全面提升我國相關(guān)傳染病診防治的整體水平。包括闡明過去 10 年我國大陸流行的 EV71 病毒的型別特點和進化特征；闡明若干與病毒毒力有關(guān)的變異位點，鑒別出一組與病毒復(fù)制和翻譯有關(guān)的宿主因子，并部分闡明其作 用機制；解析若干 EV71 變異體病毒顆粒和 3C、 3D 等重要功能蛋白及其突變體的結(jié)構(gòu)；建立我國 EV71 毒株庫，建立感染性克隆、亞基因組復(fù)制子等關(guān)鍵性研究技術(shù)平臺； 部分闡明 EV71 等病毒的致病與免疫機制。 培養(yǎng)中青年研究骨干 30 人以上，研究生 5080 名。 ―― 腦膜炎耐瑟菌重點闡明我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；同時，開展莢膜合成基因簇的表達、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移以及基因重組的調(diào)控機制研究，以期了解我國流腦菌株血清群變異的機制和規(guī)律，甄別流腦流行株和非流行株，為我 國流腦預(yù)防控制提供基礎(chǔ)性參考數(shù)據(jù)。闡明中國大陸流行的 EV71 病毒 的基因變異規(guī)律及病毒基因型別進化，闡明不同毒株在不同基因之間的進化關(guān)系和病毒衍化來源。具體思路如圖 2 所示。 腦膜炎奈瑟菌變異與 流行規(guī)律及致病機制研究 針對流行性腦膜炎，本項目擬通過體外粘附侵襲實驗、基因組序列測定、逆轉(zhuǎn)錄 PCR、熒光定量 PCR 和 RNA 測序手段分析具有不同流行特征的流腦菌株在致病性上的差異及其可能的產(chǎn)生機制。建立新型小鼠感染模型和恒河猴模型將對闡明 EV71 滅活疫苗的免疫保護機制和有效性評估提供重要理論依據(jù)。 （四）研究特色 在志賀氏菌研究方面：發(fā)達國家對志賀氏菌的研究，重點已經(jīng)轉(zhuǎn)移到痢疾志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌。 在 EV71 等病毒研究方面：本項目圍繞我國手足口病防控中急需解決的瓶頸難題，結(jié)合國際前沿進展，以病原體變異和致病機制為主線，開展 EV71 病毒遺傳變異規(guī)律及其與毒力關(guān)系 以及 EV71 等病毒復(fù)制、致病與免疫保護機制的研究。 在腦膜炎奈瑟菌研究方面：全球范圍內(nèi)，流腦的流行具有地區(qū)性或區(qū)域性，不同地區(qū)各有特點，流腦疫苗的應(yīng)用影響到流腦流行和傳播的規(guī)律。 具有資源優(yōu)勢：研究團隊中的中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所新病原室，長期從事細菌性痢疾等細菌性腹瀉病的研究，是國家細菌性痢疾監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)菌株收集、鑒定和保藏單位，已經(jīng)收集和保存不同年代、不同地區(qū)、不同血清型痢疾桿菌 4000 余株，其中福氏志賀菌 2021 余株，涵蓋目前已知的 15 個血清型 。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所團隊（病原微生物生物安全國家重點實驗室），建立了微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺，并且熟練掌握了進行毒力評價研究的多種方法和模型。 （六）課題設(shè)置 課題設(shè)置思路： 本項目繼續(xù)圍繞病原體變異規(guī)律與致病 機制這兩個傳染病基礎(chǔ)研究中的核心科學(xué)問題，根據(jù)我國傳染病防控需求，選擇四種重要病原體分別研究其變異規(guī)律及其與致病機制的關(guān)系，包括現(xiàn)階段居于我國傳染病發(fā)病率前列的痢疾、手足口病以及流行型別和模式發(fā)生轉(zhuǎn)變、對社會造成嚴(yán)重沖擊的流腦等重要傳染病的病原體，其中以手足口病和痢疾為研究重點。其中課題 2 和 3 從病毒變異和致病機制兩個方面對 EV71 進行研究，但又各有側(cè)重，這兩個課題的研究成果結(jié)合起來將對手足口病的臨床診治、預(yù)防控制、疫苗和藥物研發(fā)等提供基礎(chǔ)。 （ 2）福氏志賀氏菌優(yōu)勢血清型轉(zhuǎn)換噬菌體和流行強度的研究 通過誘導(dǎo)、獲取目前已知和未知的各種福氏志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體，對目前全基因組序列未知的噬菌體進行序列測定和生物學(xué)特征 研究；研究不同血清型轉(zhuǎn)換噬菌體單獨或組合感染及轉(zhuǎn)化福氏志賀菌的可能性和特異性，掌握多種噬菌體組合感染的時序性，了解福氏志賀菌血清型間轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律；研究各種噬菌體單獨或組合感染時在宿主菌基因組上的整合位點和排列方式，為揭示福氏志賀菌血清型間轉(zhuǎn)換及遺傳進化的分子機制提供線索；揭示血清轉(zhuǎn)換噬菌體與福氏志賀菌血清變遷的關(guān)系，闡明福氏志賀菌血清型變遷機制。本研究主要以此類毒力蛋白和重要蛋白復(fù)合物參與介導(dǎo)的志賀氏菌致病機制展開研究。全面研究和評價志賀氏菌耐藥和多重耐藥產(chǎn)生過程中獲得耐藥性的主要方式及分子機理，從而為臨床耐藥監(jiān)測和開發(fā)針對耐藥菌的新型抗菌藥物提供 潛在的分子靶位。 課題 2： EV71 等病毒變異與毒力關(guān)系的研究 主要研究內(nèi)容： （ 1）我國不同地區(qū) EV71 流行變異規(guī)律研究