【正文】 控細胞分化、細胞增殖、還是細胞遷移來誘導巨大腹側胰腺的。 A） 我們首先檢測早期內胚層或胰腺發(fā)育不同時期的分子標記，研究基因過表達或敲降導致胰腺發(fā)育缺陷表現(xiàn)型和具體發(fā)育時期； B）對于產生胰腺發(fā)育缺陷的重要調控因子，制備其抗體并進一步采用酵母雙雜交、免疫共沉淀、對 于 DNA 結合因子采用ChIPCloning，研究其相互作用因子、在染色質上的結合位點、下游基因等，深入研究其調控胰腺發(fā)育的分子機理。 3. 非洲爪蟾 胰腺特異性表達的新基因的 篩選及 功能機制研究。 2） 基因芯片比較正常的預定胰腺內胚層細胞與 BMS453 處理過的內胚層細胞、高表達了 Hex 的內胚層細胞 、 高表達了 VegT 和 βcatenin 的爪蟾胚胎多能性前體細胞的基因表達圖譜 以篩選出決定預定胰腺內胚層細胞的特異性內在 調控因子 。 A）在差異表達基因克隆并經定量 PCR 確證后，首先將研究基因的表達模式，力爭獲得 10 體節(jié)以前預定的胰內、外分泌腺 前體細胞的特異性分子標記； B）研究 mRNA 過表達、morpholino 敲降、內胚層特異性 morpholino 敲降后的胚胎表現(xiàn)型及其對胰腺不同發(fā)育時期的分子標記表達的影響； C）對于重要功能因子制備特異性抗體，并運用酵母雙雜交、免疫共沉淀、染色質免疫共沉淀（對轉錄因子或結合在染色質上的蛋白復合物成員）篩選其相互作用因子或染色質附著位點，從轉錄調控、表觀遺傳調控、蛋白相互作用調控三個方面研究這些因子調控胰腺早期發(fā)育的分子機理。 14 課題二：調控胰腺發(fā)育的分子機理研究 1. 在 斑馬魚 預定的 胰內外分泌 前體細胞中 差 異表達基因 的 篩選及其功能機制研究。 2) KLP 調控肝 臟發(fā)育 的分子機理 。 A） 生化分析DrUbc1 DrUev、 DrTraf6 與 NEMO/IKK?之間的相互作用 ； B）潛在的多泛素化蛋白敲降后 ，檢測肝臟中 NEMO/IKK?的泛素化水平的變化； C）研究導致 NEMO/IKK?泛素化水平發(fā)生變化的 K63多泛素化蛋白過表達或敲降后，對胚胎細胞核中具有活性的磷酸化 NFκB 水平以及對肝臟發(fā)育的影響；D）研究 NEMO/IKK?敲降后， K63 泛素化蛋白過表達或敲降對肝臟發(fā)育的影響，以確證 K63 多泛素化蛋白是通過 NEMO/IKK?來發(fā)揮功能的； E）建立轉基因魚，在不同發(fā)育時期誘導 K63 多泛素化蛋白過量表達，研究其對肝臟發(fā)育和 NEMO/IKK?泛素化水平的影響。 8. NEMO/IKK?及其 K63 多泛素化在調控肝臟發(fā)育中的功能與分子機理。 1） 具有 肝臟 發(fā)育缺陷突變體的表現(xiàn)型 研究。 A）建立斑馬魚全基因組基因芯片； B）利用 sox17:GFP 或 gutGFP 轉基因魚中內胚層細胞所攜帶的綠色熒光，在不同發(fā)育時期的斑馬魚胚胎中通過 FACS 技術分選內胚層細胞并制備勻漿； C）利用 H3K4Me H3K27Me H3K9/18Ac、 H4K12Ac 抗體及斑馬魚全基因組基因芯片在各時期的胚胎勻漿中進行 ChIP on Chip，系統(tǒng)地闡明不同修飾的組蛋白在內胚層 器官發(fā)育不同時期的全基因組中分布 12 變化。 4） 肝細胞 特異 性 組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶在肝細胞形成與分化中的作用與分子機 理 。 2） 肝細胞 特異的組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶的克隆 。根據(jù)體內發(fā)育研究中已有的部分線索，尋找可能參與細胞分化調控的信號通路，并分別通過配體激活或者小分子抑制，調節(jié)特定信號通路的活性，進一步分析這些信號通路對肝臟前體細胞向肝實質 細胞和膽管細胞分化的影響，從而尋找調控前體細胞向肝、膽兩譜系進行分化的關鍵信號通路。 通過免疫細胞化學方法，尋找肝臟前體細胞的表面分子標記，并利用此標記，對分化 得到的肝臟前體細胞進行流式細胞分選，從而分離并純化肝臟前體細胞 ； B） 尋找調控肝臟前體細胞形成的關鍵轉錄因子 。通過配體激活或者小分子抑制的方式，對這些候選下游信號進行特異性的激活或抑制，并通過免疫熒光、流式細胞術、 RTPCR 等方式檢測這些信號分子對向肝臟前體細胞的分化和增殖能力的影響。利用該細胞系，我們可 以定量判斷肝臟前體細胞的分化效率，并對肝臟前體細胞進行分離純化 ； B） 研究關鍵信號通路 FGF 和BMP 在分化過程中的作用 。 4. 利用胚胎干細胞體系研究肝前體及肝細胞體外分化的分子機理。 1） 肝臟 發(fā)育 不同 時期的差異表達基因的芯片篩選 。 A）根據(jù)本課題第 1 部分獲得的前腸內胚層細胞譜系定位，在 4－ 6 體節(jié)時期 的 sox17:Kaede 或sox17:Dendra 胚胎中定點激活單一類型的預定前體細胞，然后立即利用FACS 技術分選紅色熒光細胞； B）細胞分選后立即提取總 RNA 并制備芯片探針，通過基因芯片分析獲得并確證 肝臟 、腸道兩種預定的前體細胞之間及其分別與原腸中末期內胚層細胞的差異表達基因。利用激光定點激發(fā)技術，將 sox17:Kaede 或 sox17:Dendra 轉基因魚中的單個內胚層細胞轉變?yōu)榧t色熒光細胞，然后譜系定位紅色熒光細胞在內胚層器官中的位置。 8 三、研究方案 （一）技術路線 課題一：調控肝臟 和 腸道發(fā)育的分子機理研究 1. 斑馬魚體節(jié)形成早期預定的肝臟和腸道前體細胞在內胚層中的細胞譜系定位。 6. 整合已有的知識及本項目各個課 題的研究成果，深入 揭示多種 因 子 、 信號途 7 徑 、表觀遺傳機制等聯(lián)合 調控內胚層 組織 器官的前體細胞命運決定、形態(tài)建成、功能發(fā)揮和受損再生 這一連續(xù) 過程 的時空分子調控網絡 。 2. 發(fā)現(xiàn)并鑒定預定的肝臟或胰腺前體細胞的分子標記和關鍵命運決定因子，闡明其發(fā)揮功能的分子機理，填補國際上缺乏預定的肝臟和胰腺前體細胞的早期分子標記這一研究空白。 6 二、預期目標 （一）總體目標 針對內胚層組織器官的發(fā)育與再生領域研究的熱點和難點，依托并聯(lián)合運用本項目申請組已建立的斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠和胚胎干細胞研究平臺，揭示調控從內胚層細胞到肝臟和胰腺等主要內胚層器官前體細胞的命運預定和分化、到成熟功能細胞的形成、到器官的形態(tài)建成、功能發(fā)揮、和受損再生的這一動態(tài)連續(xù)發(fā)育過程中各個階段的分 子機理。 5 3. 通過增強子誘捕獲得的胰腺 GFP 標記轉基因魚的基因定位、鑒定及功能研究 。 課題三： 正向遺傳突變篩選具有 內胚層器官發(fā)育或再生缺陷的突變體及致變基因的功能機制研究 1. 斑馬魚肝臟和胰島 β 細胞再生模型的建立及 ENU 正向遺傳突變篩選研究在肝臟或胰腺發(fā)育、肝臟或 β細胞再生過程中發(fā)揮重要功能的基因及其 作用機制 。 9. 在小鼠胚胎發(fā)育過程中，確定 小鼠內胚層組織的干細胞 /祖細胞的形成 、 分化的子代細胞 譜與分化 途徑，探索內胚層組織的構筑。 7. 具有胰腺 發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機制 研究。 1）在經過早期紫外線照射形成的爪蟾 belly piece 中選擇性地恢復胰腺和肝臟形成的研究。 1）利用大規(guī)模整體原位雜交從 非洲爪蟾胚胎及成體的胰腺 cDNA 文庫中篩選胰腺特異性表達的新基因； 2）新基因調控胰腺發(fā)育的功能及分子機理研究。 1）斑馬魚 原腸中后期 內胚層細胞 、 4－ 6 體節(jié)時期 預定的 內、外分泌前體細胞 及 非預定 的胰腺 前體細胞的分選， 四 者差異表達基因的芯片篩選 ；2）差異表達基因的表達模式、功能和作用機制研究。 1）NEMO/IKK?及其多泛素化在調控斑馬魚肝臟發(fā) 育中的功能； 2） NEMO/IKK?多泛素化酶的確定及其在肝臟發(fā)育中的功能 。 1）在 斑馬魚 內胚層 器官發(fā)育的不同階段 對 H3K4Me H3K27MeH3K9/18Ac、 H4K12Ac 的表觀遺傳穩(wěn)定性及功能 的系統(tǒng) 化 研究； 2）選取 具有代表性的 表觀遺傳 位點，研究染色質 上相應位點 附近基因 在調控 內胚層器官 發(fā)育 中的 功能 及分子機理 。 1）胚胎干細胞向肝臟前體細胞分化過程中命運決定的分子機理； 2）胚胎干細胞來源的肝臟前體細胞的基因表達特性分析，影響其定向分化的關鍵基因的尋找及作用機理研究； 3）胚胎 干細胞來源的肝臟前體細胞的體外分化能力及分子機理研究。 1） 4－ 6 體節(jié)時期 斑馬魚預定的肝臟 、腸道 前體細胞 分選， 兩者 之間及其分別與原腸中期內胚層細胞 差異表達基因的芯片篩選 ； 2）差異表達基因發(fā)揮功能的分子機理 研究。 項目名稱： 調控內胚層組織器官發(fā)育的分子機制研究 首席科學家： 羅凌飛 西南大學 起止年限： 至 依托部門： 教育部 重慶市科委 1 一、研究內容 在本項目擬開展的研究工作中，我們將應用斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠等模式動物和胚胎干細胞研究體系，以肝臟和胰腺這兩個重要的內胚層器官為主要研究對象，輔以腸道的研究，沿著從內胚層細胞到內胚層器官前體細胞的命運預定、到前體細胞的分化和成熟功能細胞的形成、到器官的形態(tài)建成、功能發(fā)揮、和受損再生的動態(tài)連續(xù)過程，全面深入地研究在內胚層組 織器官特別是肝臟和胰腺的發(fā)育和再生過程中發(fā)揮重要功能的因子、信號途徑和表觀遺傳穩(wěn)定性的作用機制，并闡明其中可能存在的時間、空間網絡關聯(lián)。 2. 在 斑馬魚 預定的肝臟 或腸道 前體細胞中 特異和差 異表達基因 的 篩選及其功能機制研究。 4. 利用胚胎干細胞體系研究肝前體及肝細胞體外分化的分子機理。 6. 表觀遺傳在 斑馬魚 內胚層器官發(fā)育的不同階段的穩(wěn)定性及其功能的系統(tǒng)研究。 8. NEMO/IKK?的 K63 多泛素化在調控肝臟發(fā)育中的功能與分子機理。 課題二：調控胰腺發(fā)育的分子機理研究 1. 在 斑馬魚 預定的 胰內外分泌 前體細胞中 差 異表達基因 的 篩選及其功能機制研究。 3. 非洲爪蟾胰腺特異性表達的新基因的篩選及功能機制研究。 5. 非洲爪蟾胚胎胰腺和肝臟的體外重建。 1）分別建立 pdx1和 ngn3 啟動子驅動的報告體系； 2）研究 RA, BMP, FGF 等信號途徑調控pdx1 表達的分子機理； 3）胰腺前體細胞的基因表達譜分析，胰腺前體細胞向內分泌細胞分化過程中的信號調控機制研究； 4）胰內分泌前體細胞的基因表達譜分析， Ngn3 下游調控基因的表達譜分析 。 1） 利用三維培養(yǎng)體系，從小鼠胚胎和新生小鼠體內分離和富 集 內胚層組織的干細胞 /前體細胞，確定其表面標記 ； 2） 分析成體小鼠內的干細胞 /前體細胞組分 ； 3） 分析 內胚層組織 干細胞 /前體細胞的 特異 基因表達模式，確定干細胞 /前 體 細胞內特異基因表達 ； 4） 建立體外干細胞 /前體細胞分化體 4 系 ， 確定內胚層 組織的 細胞分化譜 ； 5） 建立體內細胞分化測定體系，確定體內分化 細胞 譜，比較體內外分化譜的異同，明確 內胚層組織的 細胞分化測定手段。 1）確定內胚層發(fā) 育的特異基因 ； 2）構建條件性基因打靶的 ES 細胞 ， 體外分析細胞的分化能力 ； 3）構建條件基因打靶小鼠 ； 4）分析內胚層分化發(fā)育的分子基礎與分子機制。 1）斑馬魚胰外分泌腺再生模型的建立及再生的細胞過程研究； 2） ENU 化學誘變篩選具有胰外分泌腺再生缺陷的突變體及其表現(xiàn)型研究； 3）致變基因的克隆和功能機制研究。 1） 攜帶轉座子的轉基因斑馬魚的建立； 2）具有肝臟 、胰腺或腸道 發(fā)育缺陷的突變體篩選； 3）致變基因的克隆和功能機制研究。 （二）五年預期目標 1. 建立并完善我國利用模式動物和 胚胎 干細胞研究 以 肝臟 和 胰腺 為代表的 內胚層 組織 器官發(fā)育 和再生 的研究體系。 5. 同時以胚胎干細胞和斑馬魚為研究體系，闡明表觀遺傳機制特別是組蛋白修飾機制在調控內胚層組織器官發(fā)育中的功能及機制。 9. 通過項目培養(yǎng)青年科技骨干人才， 培養(yǎng)高水平博士后 5－ 10 人、博士研究生50－ 70 人 ；建立并逐漸壯大 一 支 活躍 在 內胚層 組織 器官發(fā)育研究領域的創(chuàng)新團隊和中青年學術帶頭人隊伍 ，并至少 有兩位青年科學家在項目實施過程中獲得國家杰出青年基金資助 。 2） 4－ 6 體節(jié)時期預定的肝臟和腸道前 體細胞在內胚層中的細胞譜系定位。 1） 4－ 6 體節(jié)時期 斑馬魚預定的肝臟 、腸道 前體細胞 分選， 兩 者 之間及其分別與原腸中期內胚層細胞 差異表達基因的芯片篩選 。 3. 肝細胞命運決定后調控 肝臟發(fā)育基因 的 篩選與功能研究。 對于 通過基因芯片 獲得 的 新基因 ，我們 將 利用基因 過表達 和敲降 、 內胚層特異性敲降、 整體原位雜交、 免疫組化 、酵母雙雜交、免疫共沉淀、染色質免疫共沉淀等方法 研究 新基因的 功能 及其作用機理 。 Afp 的表達標志著內胚層細胞進一步分化為肝臟前體細胞，因此我們將采用同源重組的方式，建立 afp 啟動子驅動報告基因表達的胚胎干細胞系。進一步，我們將對 FGF 和 BMP 信號通路及其下游重要 10 信號通路 在胚胎干細胞向肝臟細胞分化過程中的功能進行深入分析。 A） 尋找表面標記，用于分離 純化肝臟前體細胞 。 3） 胚胎干細胞來源的肝臟前體細胞的體外分化能力及分子機理研究。 在肝細胞分化的不同階