【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 422 2 分子截留 截留率、截留曲線 影響截留的因素： ? 相對(duì)分子質(zhì)量 ? 分子特性 ? 其他溶質(zhì) ? 操作條件 2020422 3 膜電位 濃度不等，選擇透過離子造成電位差 2020422 五、影響膜分離速度的因素 ? 操作形式：錯(cuò)流過濾 ? 流速： Jv正比于流速，受流動(dòng)形式、菌體特性影響 ? 壓力（圖 1348） 一定流速下， Jv、凝膠層厚度隨壓力增加而增加至 Jv到達(dá)極限值：增長(zhǎng)的 Jv恰好抵消凝膠層增厚帶來的影響。 ? 料液濃度（圖 1349） 2020422 六、膜分離法在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用 ? 超濾和微濾 ? 反滲透 ? 滲透蒸發(fā) ? 液膜技術(shù) ? 膜反應(yīng)器 膜循環(huán)反應(yīng)器 膜滲析反應(yīng)器 2020422 七 電滲析分離 ? 作用原理： 在外電場(chǎng)作用下，膜的可移動(dòng)離子移動(dòng) → 在電極與固定基團(tuán)間形成足夠強(qiáng)烈的電場(chǎng)，產(chǎn)生吸引力，此固定基團(tuán)能把與其帶相反電荷的離子吸入到膜的活性中心 → 進(jìn)一步被更強(qiáng)電性的電極吸引，發(fā)生離子的定向移動(dòng)，從而將不同大小和電性的離子分離。 2020422 1 概述 ? 離換膜電滲析裝置：由膜、電極、滲析池、直流電源等組成。 ? 膜的分類：濃縮、脫鹽、電解 ? 工業(yè)用離子交換膜要求條件 2020422 ? (1)高的離子透過性； ? (2)好的導(dǎo)電性； ? (3)小的擴(kuò)散量； ? (4)小的遷移量； ? (5)一定的機(jī)械強(qiáng)度； ? (6)化學(xué)穩(wěn)定性好； ? (7)均勻光潔； ? (8)膨脹性?。? ? (9)價(jià)格便宜； 2020422 ? 影響離子交換膜電滲析的因素 （ 1）膜電位： ? 膜電位是由膜兩側(cè)溶液中離子濃度不等和膜的選擇透過性能所引起。 ? 膜電位的產(chǎn)生會(huì)促進(jìn)一種離子擴(kuò)散而抑制另一種離子的擴(kuò)散。 2020422 （ 2）結(jié)垢 因生成氫氧化物而出現(xiàn)。 ? 解決措施： 正負(fù)電極反接；也可用 HCl、 H2SO4調(diào) pH，或添加偏磷酸鈉。 （ 3）極化 工作狀態(tài)下，因離子 “ 真空 ” 現(xiàn)象出現(xiàn)，而導(dǎo)致水離解為 H＋和 OH－離子的現(xiàn)象。 2020422 2 離換膜電滲析制備無機(jī)鹽水 離換膜電滲析制備無機(jī)鹽水 ＋＋＋＋＋＋－－－－－－1C?1C?1C?1C?1C?1C?Na?Na?Na?Na?Na?Na?1 2 3 4 5 陽 膜 陰 膜 陽 膜 陰 膜陰 極陽 極濃 縮 室 淡 化 室 濃 縮 室圖 1 3 － 3 9 電 滲 析 過 程 原 理 示 意 圖2020422 ? 電滲析器及其脫鹽流程設(shè)計(jì) ＋＋＋＋＋＋ －－－ －( a ) ( b ) ( c )( d )圖 1 3 － 4 2 液 體 在 各 種 組 裝 形 式 電 滲 析 器 中 的 流 動(dòng)( a ) 一 級(jí) 一 段 并 聯(lián) ； ( b ) 二 級(jí) 一 段 并 聯(lián) ； ( c ) 一 級(jí) 二 段 并 聯(lián) ； ( d ) 二 級(jí) 二 段 串 聯(lián)進(jìn) 水 進(jìn) 水 進(jìn) 水 進(jìn) 水2020422 （ a ） （ b )濃 縮 液稀 釋 液原 液濃 縮 液 稀 釋 液原 液濃 縮 液原 液稀 釋 液( c )圖 1 3 － 4 3 電 滲 析 器 的 脫 鹽 流 程（ a ） 一 次 通 過 連 續(xù) 式 ； ( b ) 部 分 循 環(huán) 式 ； ( c ) 循 環(huán) 間 歇 式2020422 （ 2） 確定參數(shù) ? 脫鹽級(jí)數(shù)：多級(jí) ? 操作電流密度：推動(dòng)力 、 溶液電阻 、 電極反應(yīng) 、 漏電 ? 膜面積等 2020422 八 膜的污染及清洗 1. 膜污染原因 ? 凝膠層 ? 表面吸附層 ? 孔堵塞 ? 孔內(nèi)吸附 2020422 （ 1） 減輕膜污染的方法 ａ ． 原料液預(yù)處理及溶液特性控制 ｂ ． 膜材料與膜的選取 ｃ ． 膜組件及膜器運(yùn)行條件選擇 2020422 （ ２ ） 膜的清洗與保存 ａ ． 清洗方法：清洗劑 ， 反洗 ， 循環(huán)洗 ｂ ． 膜的保護(hù)：預(yù)處理 、 滅菌 、 操作條件選擇 2020422 5 層析法 ? 層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：固定相 +流動(dòng)相 ? 待分離的混合物通過固定相時(shí) ， 與兩相發(fā)生相互作用 （ 吸附 、 溶解 、 結(jié)合等 ） 的能力不同 ， 在兩相中的分配 （ 含量對(duì)比 ） 不同 ， 隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度不同 。 ? 分部收集流出液 ， 可得到樣品中所含的各單一組份 。 2020422 按兩相所處狀態(tài)分類 流動(dòng)相 液體 氣體 液體 液 液層析法 氣 液層析法 固定相 固體 液 固層析法 氣 固層析法 2020422 按層析原理分類 名稱 分離原理 吸附層析法 組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑，各能力不同 分配層析法 各組份在流動(dòng)相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同 離子交換層析法 固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同 凝膠層析法 固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同 親和層析法 固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份分離 2020422 按操作形式不同分類 名稱 操作形式 柱層析法 固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)分離 薄層層析法 將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開，使各組份分離 紙層析法 用濾紙作液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開，使各組份分離 薄膜層析法 將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進(jìn)行物質(zhì)的分離 2020422 二 層析機(jī)理 1 排阻層析 (exclusion chromatography) 利用凝膠層析介質(zhì) (固定相 )交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時(shí)能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動(dòng)相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為排阻層析。 2020422 2 離子交換層析（ IEC） ? 原理：離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中溶質(zhì)靜電引力差異來進(jìn)行分離的一種方法。 ? 特點(diǎn)： ? 料液處理量大 ? 應(yīng)用范圍廣，操作條件優(yōu)化余地大 ? 產(chǎn)品回收率高 ? 技術(shù)成熟，價(jià)格適宜 2020422 2020422 3 分配層析 (partition chromatography) 被分離組分在固定相和流動(dòng)相中不斷發(fā)生吸附和解吸附的作用，在移動(dòng)的過程中物質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配。被分離物質(zhì)在兩相中由于分配系數(shù)的差異而分離。 2020422 4 親和層析 (affinity chromatography) 固相表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基，與流動(dòng)相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合。 2020422 5 疏水層析 (hydrophobic chromatography) 固相偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離的方法。 2020422 6 聚焦層析 (focusing chromatography) 利用固定相載體上偶聯(lián)的載體兩性電解質(zhì)分子，在層析過程中所形成的 pH梯度，并與流動(dòng)相中不同等電點(diǎn)的分子發(fā)生聚焦反應(yīng)進(jìn)行分離的方法，稱之為聚焦層析。 ? 洗脫中分離 ? 可濃縮 2020422 7 反相層析 (reverse phase chromatography) 利用固相載體上偶聯(lián)的疏水性較強(qiáng)的配基，在一定非極性的溶劑中能夠與溶劑中的疏水分子發(fā)生作用，以非極性配基為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相來分離不同極性的物質(zhì)的方法，稱之為反相層析。 ?硅膠載體 ?分辨率高，貴 ?不能用來分離大的蛋白（變性） ?為什么叫反相 (reverse phase)呢 ? 2020422 8 羥基磷灰石層析 ? 利用鈣離子和磷酸根離子的景點(diǎn)引力吸附 ? 再用磷酸鹽緩沖液競(jìng)爭(zhēng)吸附來洗脫 ? 便宜，適宜規(guī)模化 2020422 9 超臨界流體層析（ SFC） ? 固定相： ODS ? 流動(dòng)相：超臨界流體 ? 操作：高壓，梯度洗脫 10 灌注層析 (perfusion chromatography) 大的穿透孔 + 短程擴(kuò)散孔 適宜快速分離 2020422 二、凝膠層析法的原理 : ? 兩種運(yùn)動(dòng) —— 垂直向下運(yùn)動(dòng)和布朗運(yùn)動(dòng)。 ? 大分子：分布于凝膠顆粒的間隙，以較快的速度流過層析柱； ? 小分子：能不斷地進(jìn)出于一個(gè)又一個(gè)的顆粒微孔的內(nèi)外； ? 組分：分子按由大到小的順序先后而分離。 2020422 2020422 l 混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外； 3 大小分子分開： 4 大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中 2020422 凝膠裝置圖 色譜峰和分離結(jié)果 2020422 Vt=Vo+Vi+Vg Vt=πR2h= 柱體積 Vo：等于被完全排阻的大分子的洗脫體積 。 可以用一個(gè)已知相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)超過凝膠排阻極限的有色分子 ， 如常用的藍(lán)色葡聚糖 2020溶液通過柱床 ， 即可測(cè)出柱床的外水體積 Vo。 Vi：內(nèi)水體積 ， 可由 g Wr求得 （ g為干凝膠質(zhì)量 ， 單位為 g，Wr為凝膠吸水量 ， 以 mL／ g表示 ） 。 Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(zhì) （ 如重鉻酸鉀 ） 的洗脫體積 Ve計(jì)算 ， Ve＝ Vo＋ Vi Vg：干凝膠體積 2020422 洗脫體積 Ve＝ Vo＋ Ve包括自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的體積 Kd為每個(gè)溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相之間的一個(gè)特定的分配系數(shù)，它只與被分離物質(zhì)分子大小和凝膠顆粒內(nèi)孔隙大小分布有關(guān)。 Kd可通過實(shí)驗(yàn)由 Ve、 Vo和 Vi求得。 2020422 ?Kd愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大；當(dāng) 0＜ Kd＜ l時(shí)，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散。 ?Kd＝ 0時(shí)， Ve=Vo，說明這種溶質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來； ?Kd＝ 1時(shí)，即 Ve小分子 ＝ Vo＋ KdVi，說明這種溶質(zhì)完全向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散，在洗脫過程中將最后流出柱外。 ?實(shí)際上，約 1/5的內(nèi)水因溶劑化作用而呈水合狀態(tài)，妨礙小分子的自由擴(kuò)散。故實(shí)際上 Ve小分子 ＝ Vo＋ ； Kd = （ VeVo） /Vi 2020422 三 、常用凝膠 : ? 由于膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì) ,其內(nèi)部具有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) .層析法中常用凝膠有 : ? : ? (1)馬鈴薯淀粉凝膠 ? (2)瓊脂和瓊脂糖凝膠 ? : ? (1)聚丙烯酰胺凝膠 ? (2)交聯(lián)的葡萄糖凝膠 2020422 （ 1）瓊脂糖凝膠 （ agarose gel） ?由瓊脂中分離出來的天然凝膠，依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。 ?可分離相對(duì)分子質(zhì)量 108的大分子及病毒，但由于瓊脂的強(qiáng)吸附作用，洗脫困難， ?瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能溶脹恢復(fù)原有形狀。一般懸浮在 l03 mo1/L EDTA和 %疊氮化鈉溶液中。 2020422 ?瑞典 Sepharose， 3種型號(hào)，即 Sepharose 2B， 4B和 6B（同中國(guó)相同）。阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。 ?美國(guó) Bio－ GA，有 6個(gè)型號(hào)，即 BioG ， ， 5M， 15M，50M和 150M。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以 106表示排阻限度。 ?英國(guó) Sagavac，又分為 Sagavac 2F， 4F， 6F， 8F， 10F和 2C，4C， 6C， 8C， 10C。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分?jǐn)?shù)， F代表粉末狀， C代表顆粒狀。 ?丹麥 Gelar