dna與rna提取方法及原理與提取方法及原理dna提取專題dna提取專題第一部分(編輯修改稿)
2025-07-04 13:32 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 致開環(huán)質(zhì)粒增加） 培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力， 培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則 菌體易污染， 菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒， 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為 低拷貝或大質(zhì)粒， 低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌 體用量 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 細(xì)胞裂解基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解， 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解， 導(dǎo)致DNA量少，純度低 量少， 導(dǎo)致 量少 針對不同材料， 針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧?解預(yù)處理方式： 解預(yù)處理方式： 植物材料－－ －－液氮研磨 植物材料－－液氮研磨 動物組織－－ －－勻漿或液氮研磨 動物組織－－勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞－－蛋白酶K －－蛋白酶 組培細(xì)胞－－蛋白酶 細(xì)菌－－ －－溶菌酶破壁 細(xì)菌－－溶菌酶破壁 酵母－－ －－破壁酶或玻璃珠 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時(shí)， 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 菌體量適當(dāng) 培養(yǎng)基去除干凈， 培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌 體在懸浮液中充分懸浮 變性的時(shí)間不要過長（ 分鐘 分鐘）， 變性的時(shí)間不要過長（5分鐘）， 否則質(zhì)粒易被打斷 復(fù)性時(shí)間也不宜過長， 復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會 有基因組DNA的污染 有基因組 的污染 G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先 酵母質(zhì)粒的提取， 用酶法或機(jī)械法處理， 用酶法或機(jī)械法處理，以破壁 ? ? ? ? ? 核酸分離、 核酸分離、純化基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提 時(shí) 采用吸附材料吸附的方式分離 供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)（ 氯仿 抽提時(shí)應(yīng)充分混勻， 氯仿） 采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但 動作要輕柔 離心分離兩相時(shí)， 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 針對不同材料的特點(diǎn)， 針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相 應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 核酸分離、 核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除： 蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌 蛋白酶處理 核酸分離、 核酸分離、純化多糖的去除： 多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體 高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體 1/2 積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。 用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積) 在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可 (1/2體積 以與多糖的羥基作用， 以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 代替乙醇沉淀DNA DNA： DNA液中加入 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 冰浴20min 20min。 200μl 20% PEG8000 ( M NaCl) ，冰浴20min。 核酸分離、 核酸分離、純化多酚的去除： 多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β巰基乙醇、 巰基乙醇、 抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 抗壞血酸、半胱氨酸、 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 加入易與酚類結(jié)合的試劑： PVP、PEG(聚乙二醇) 聚乙二醇 們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA DNA的結(jié)合 們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合 鹽離子的去除： 鹽離子的去除： 70％ 70％的乙醇洗滌 核酸沉淀、 核酸沉淀、溶解基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀， 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀， 沉淀會更充分 沉淀時(shí)加入1/10體積的 體積的NaOAc（，3M），有 ），有 沉淀時(shí)加入 體積的 （ ， ）， 利于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌， 沉淀后應(yīng)用 ％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） ，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 晾干 若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解 若長期儲存建議使用 緩沖液溶解 ? ? TE中的 中的EDTA能螯和 2+或Mn2+離子，抑制 能螯和Mg 離子，抑制DNase 中的 能螯和 pH值為 ，可防止 ，可防止DNA發(fā)生酸解 值為 發(fā)生酸解 基因組DNA的檢測 基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在 片段在20kb－30kb之間 提取的基因組 片段在 － 之間 高質(zhì)量的基因組DNA帶型 單一無拖尾現(xiàn)象 帶型 高質(zhì)量的基因組 DNA濃度及純度的檢測 A260=1 約 50 ?g/ mL 雙鏈 濃度及純度的檢測 雙鏈DNA； ； A260/280 約為 DNA提取常見問題 DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純 抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。 樣品不純， PCR反應(yīng) 問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。
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