dna與rna提取方法及原理與提取方法及原理dna提取專題dna提取專題第一部分-資料下載頁
2025-06-07 13:32本頁面
【正文】 、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 酶也有一定抑制作用 RNA提取專題 RNA提取專題第一部分： 第一部分：RNA提取方法簡介 提取方法簡介 第二部分：RNA提取及常見問題分析 第二部分： 提取及常見問題分析 RNA提取的步驟 RNA提取的步驟材料的裂解異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇， 異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇， N月桂肌氨酸 等。使細(xì)胞及核蛋白復(fù) 月桂肌氨酸 合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸 合物變性，釋放 ， 酶。 苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物， 苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物， 及蛋白沉淀到有機(jī)相。 使DNA及蛋白沉淀到有機(jī)相。 及蛋白沉淀到有機(jī)相 雜質(zhì)的去除 RNA的吸附或沉淀 的吸附或沉淀 硅質(zhì)材料的吸附 或用異丙醇沉淀濃縮RNA。 或用異丙醇沉淀濃縮 。 處理的水溶解RNA 經(jīng)DEPC 處理的水溶解 材料準(zhǔn)備及裂解 RNA的提取 的提取盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位， 盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位， 現(xiàn)取現(xiàn)提。 現(xiàn)取現(xiàn)提。 組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組 組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清， 織選取雜質(zhì)少的部位, 細(xì)菌和酵母需要勻漿處理。 織選取雜質(zhì)少的部位 細(xì)菌和酵母需要勻漿處理。 對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍， 對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入 專門的RNA樣品儲存液中保存。 樣品儲存液中保存。 專門的 樣品儲存液中保存 液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補(bǔ)充； 液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補(bǔ)充；加入裂解液并且徹 底而迅速地勻漿。 底而迅速地勻漿。 雜質(zhì)的抽提 RNA的提取 的提取采用有機(jī)（ 采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻 氯仿） 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間，使蛋白質(zhì)、多糖和 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間，使蛋白質(zhì)、 DNA分布到中間層和有機(jī)相中 RNA留在水相中 分布到中間層和有機(jī)相中， DNA分布到中間層和有機(jī)相中，RNA留在水相中 對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層， 對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機(jī)溶 劑抽提 RNA的沉淀和溶解 的沉淀和溶解 RNA的提取 的提取含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖 RNA的水相過吸附柱， 的水相過吸附柱 等雜質(zhì) 或使用異丙醇沉淀RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min左右離心收集 或使用異丙醇沉淀RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min左右離心收集 RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min 沉淀，70％乙醇洗滌， 沉淀，70％乙醇洗滌，晾干 用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解 處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解RNA 用經(jīng) 處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解 樣品收集后或需長期保存時應(yīng)置于－ ℃ 或加入RNase抑制劑， 抑制劑， 樣品收集后或需長期保存時應(yīng)置于－70℃ 或加入 抑制劑 分裝使用 RNA的檢測 的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理 乙二醛化瓊脂糖凝膠電泳 含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳 RNA純度及濃度的檢測 純度及濃度的檢測（A260=1 ，約40 ?g/ mL RNA； ； ） A260/A280 約為 RNA提取常見問題 提問題一： 問題一： RNA樣品不純 樣品不純 原因 1 保證徹底的裂解和一定 轉(zhuǎn)數(shù)一定時間的離心； 轉(zhuǎn)數(shù)一定時間的離心； 增加有機(jī)溶劑抽提的次 數(shù)，用吸附柱純化 減少處理樣品的量； 2 減少處理樣品的量；加 入不含RNase的DNase處 入不含RNase的DNase處 RNase 理；再次純化 3 增加漂洗次數(shù) 抽提過程不徹底存 在蛋白或多糖多酚 的污染 2 DNA 的污染 3 離子濃度較高 1 對 策 RNA提取常見問題 提問題二： 問題二： RNA得率低 得率低 原因 1 去除樣品中的雜質(zhì)，離 去除樣品中的雜質(zhì)， 心除凈樣品中的培養(yǎng)基 或儲存液 減少樣品用量； 2 減少樣品用量；充分研 磨樣品， 磨樣品，增加裂解液的 用量和裂解的時間 3 延長吸附時間或保證異 丙醇沉淀的時間和離心 時間； 時間；再次洗脫 重復(fù)吸附， 4 重復(fù)吸附，加入肝糖等 有助RNA沉淀的試劑 有助RNA沉淀的試劑 RNA 1 樣品含有雜質(zhì)雜液 2 樣品過量或樣品裂解 和勻漿不徹底 RNA未有效的吸附沉 3 RNA未有效的吸附沉 淀或洗脫 樣品RNA RNA含量少 4 樣品RNA含量少 對 策 RNA提取常見問題 提問題三：RNA容易降解 問題三：RNA容易降解 原因 1 盡量取新鮮的樣品； 盡量取新鮮的樣品；取樣 后立即放入液氮保存； 后立即放入液氮保存；或 放入專門的儲存液內(nèi)； 放入專門的儲存液內(nèi)；研 磨樣品及時補(bǔ)充液氮 2 認(rèn)真地處理相應(yīng)的器具和 試劑； 試劑；嚴(yán)格地操作 凍存，分裝使用； 3 70℃ 凍存，分裝使用； 加入RNase RNase抑制劑 加入RNase抑制劑 樣品不新鮮或樣品 保存不當(dāng)，RNA降解 保存不當(dāng)，RNA降解 污染了RNase 2 污染了RNase 3 樣品儲存不當(dāng)
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