【文章內(nèi)容簡介】 109 340 污泥修復(fù)的土壤；未污染的 7800 1010 9800 污泥修復(fù)的土壤；低金屬的 3700 1010 4600 污泥修復(fù)的土壤；高金屬 的 1200 109 1500 注： 土壤群落 DNA 大小用堿基對（ bp），相等的大腸桿菌基因組（ ： 106bp）（ (Br248。nstad等 . 1996。 Dr248。nen 等 . 1998）。 C0代表摩爾核苷酸每升， t 代表時間 /秒 為了估計原核生物的多樣性， DNA必須高度純化并且與真核生物的 DNA區(qū)分開來。因此，必須使用一種間接地 DNA 提取方法將土壤中的細(xì)菌分離開，即在細(xì)胞溶解之前進(jìn)行分級離心。 另外， 為了更加精確地估計高純度的 DNA，必須使用統(tǒng)一的片段長度。從土壤微生物 群落中提取的 DNA 通常很復(fù)雜，重聯(lián)率也很低，但是如果在檸檬酸鹽溶液和 30%DMSO 中測量時它將會提高。然而，為了更好的估計 C0t1/2值 需要重復(fù)多次以達(dá)到 50%的重聯(lián)率。 大片段的土壤群落 DNA（ 100kb）不用 PCR 擴(kuò)增就可以直接克隆進(jìn) BAC 載體。從F質(zhì)粒獲得的 BAC 載體可以在大腸桿菌宿主內(nèi)穩(wěn)定地保存大的插入序列。在理論上，BAC 文庫可以 容納全部的微生物群落基因組，并且可以用來繪制基因組圖譜、篩選特殊物種、評估系統(tǒng)發(fā)育分析和功能多樣性。這可以通過與特殊探針進(jìn)行雜交、遺傳指紋識別和測序來實(shí)現(xiàn)。這種方法的一 個優(yōu)點(diǎn)是不要通過 PCR 擴(kuò)增，因而避免了許多其他指紋識別和測序技術(shù)中這一步驟的缺陷。每一個 BAC 克隆代表一個元基因組片段 ，它可能包含具有它們自己啟動子的基因和操縱子，從而能夠使它們在大腸桿菌宿主中表達(dá)。 所以，土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育和功能之間的關(guān)聯(lián)信息可以通過克隆體的結(jié)合研究來隱藏 rRNA，功能性的基因則可以通過克隆和雜交 來獲得。 核糖體 RNA 基因（ rDNA） 以及 它們的 轉(zhuǎn)錄片段和 rRNA 分子是分類鑒定和衡量微生物遺傳多樣性最常用的標(biāo)記物。 基于 rRNA 的方法已經(jīng)顯示了原核微生物中高度發(fā)散的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系， 它代表了地球上 絕大多數(shù)的遺傳多樣性。這種非培養(yǎng)的 rRNA 方法揭示了新的血統(tǒng)，在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)角度不同于培養(yǎng)方法和特征性的土壤探針。他們表明來自相似棲息環(huán)境不同地理區(qū)域的微生物有相關(guān)性，但是 具有相同官能團(tuán)的微生物可能屬于不同的系統(tǒng)發(fā)生組（親緣型），這反映了生態(tài)位的不同。 Tiedje 等質(zhì)疑微生物是世界性的這個假說，他們發(fā)現(xiàn)每一相同大陸區(qū)域每一個 取樣點(diǎn)微生物的基因型都是特異性的。 6 土壤微生物群落的遺傳指紋圖譜和通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序 12 列來鑒定群落成員 基于 PCR 擴(kuò)增的遺傳指紋圖譜方法在分離擴(kuò)增物方法有很多不同的方法。像末 端限制性片段長度多態(tài)性 ， 這樣的新方法使用熒光標(biāo)記 PCR 擴(kuò)增物，然后 通過 在自動測序系統(tǒng)中使用 激光檢測熒光 DNA 片段來分離 PCR 產(chǎn)物?；?PCR 的群落指紋圖譜技術(shù)有許多的優(yōu)點(diǎn)， 包括：快速，可以平行分析大量的樣品；可靠，高度的可重復(fù)性；提供一個群落里的種群的性質(zhì)和數(shù)量上的信息；可以通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序列來評價群落成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。但是，基于 PCR 的技術(shù)也有很多的缺陷，例如 ：由于優(yōu)先擴(kuò)增某些細(xì)菌的目標(biāo) DNA 序列而導(dǎo)致的 PCR 擴(kuò)增差異；形成嵌合分子；由于許多的操縱子的存在導(dǎo)致從一株細(xì)菌獲得許多不同的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；復(fù)雜群落的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量太多以至于很難分離和分析。 用 DGGE 和 TGGE 的方法 PCR擴(kuò)增 rDNA 的 DNA指紋圖譜可以提供群落組成的信息。在 DGGE/TGGE 方法中，相同長度但是不同核苷酸序列的 DNA 片段被分離。這種分離是基于 在一個線性變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中 PCR擴(kuò)增的 DNA分子具有不同的遷移率。 DGGE 依靠變性物質(zhì)（尿素和甲酰胺）的濃度梯度，而 TGGE 卻基于溫度梯度。具有不同序列的 DNA 分子在熔解時將會產(chǎn)生差異。隨著 DNA 分子在變性凝膠中遷移，它們開始在特定的熔解區(qū)熔解，因此它們開始變成部 分單鏈。部分變性的或者全部變性的分子停止在凝膠中遷移， DNA 片段由于不同的堿基組成和序列而在凝膠上占據(jù)不同的位置。 使用可以與可變區(qū)附近的保守區(qū)退火的引物，對 微生物群落 DNA 中的 rDNA的可變區(qū)（ 230500bp）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。前面的引物與富含 G+C 的序列（ GC夾子，通常達(dá) 40bp 長度）相共價連接以阻止雙鏈全部解鏈。 這種技術(shù)的一個不足就是不同生物的 16SrDNA 能夠在變性凝膠上形成一條特定的條帶。但是， 當(dāng)應(yīng)用于不是很復(fù)雜的群落時， 就可以 假設(shè)通過 DGGE/TGGE 獲得的可辨別的條帶代表群落中的大量的優(yōu)勢微生物種群。群落的分類學(xué)組成信息可以通過凝膠印跡和與遺傳分子探針雜交、靶標(biāo)細(xì)菌和古生菌中的主要的系統(tǒng)發(fā)育亞種。分離較好的 DGGE 條帶可以從凝膠上切下來進(jìn)行測序。把 DGGE 條帶的序列與數(shù)據(jù)庫中的序列比較，可以獲得原來微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育聯(lián)系。 DGGE/TGGE 方法分析 從反轉(zhuǎn)錄 PCR 的 rRNA 分子獲得的 PCR 擴(kuò)增物或許可以得出代謝活躍的微生物種群的指紋圖譜。 DGGE/TGGE 在快速篩選大量樣本以區(qū)分土壤微生物群落時很有效。 它們在調(diào)查微生物群落空間和時間的差異時很方便，可以提供優(yōu)勢菌群的變化信息。 SSCP，像 DGGE/TGGE 一樣，可以檢測從 rDNA 可變區(qū)獲得的不同 PCR 擴(kuò)增物的序列變化。在 SSCP 中，一個引物是在 5’端磷酸化的，并且擴(kuò)增物中磷酸化的鏈被 λ 核酸外切酶選擇性的酶切。 完整的鏈通過在非變性條件下（低溫）優(yōu)化的 SSCP 聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。這種優(yōu)化的凝膠限制雙鏈但是允許 DNA 鏈的分子內(nèi)部折疊。這種 13 方法是基于單鏈 DNA 的不同分子內(nèi)折疊，其本身取決于 DNA 序列的變化。因此， DNA二級結(jié)構(gòu)改變了單鏈 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移速率，從而使其被分辨出來。這種方法的可重復(fù)性和辨別能力取決于片段的大小和片段內(nèi)序列變化的 位置，通常片段小于400bp 效果最理想。 SSCP 已經(jīng)被用于區(qū)別純培養(yǎng)的土壤微生物和不同植物不可培養(yǎng)的根圍微生物群落的群落指紋圖譜。 SSCP 方法原則上比 DGGE/TGGE 方法要容易操作，因?yàn)樗恍枰獛?GC 夾子的引物和梯度凝膠所需要的特殊儀器。除了 PCR 本身存在的誤差以外，這種方法的一個不足就是某一單個細(xì)菌物種可能 產(chǎn)生許多條帶，因?yàn)樵S多操縱子的存在或者單鏈 PCR 擴(kuò)增物有很多個構(gòu)象。 TRFLP方法是基于對末端熒光標(biāo)記的 PCR擴(kuò)增物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶酶切的一種方法。這些 PCR 擴(kuò)增物通過使用引物連接到 rRNA 基因可變區(qū)附近的一致性序列而從微生物群落 DNA 獲得。兩個引物通常都是使用熒光亞磷酰胺染料標(biāo)記 5’末端。然后擴(kuò)增物通過限制性酶切再進(jìn)行凝膠或者毛細(xì)管凝膠電泳分離。熒光標(biāo)記的片段可以在自動分析儀里通過熒光檢測器進(jìn)行檢測 ，因此，這種技術(shù)只檢測末端標(biāo)記的限制性片段。所以， TRFLP 結(jié)合了 PCR、 RFLP 和凝膠電泳三種技術(shù)。通過使用計算機(jī)程序在數(shù)據(jù)庫中在 16SrDNA 序列上確定恰當(dāng)?shù)南拗菩?酶切位點(diǎn)， 不同的限制性酶切出的 rRNA 的TRF 片段大小差異可以預(yù)測出來，實(shí)驗(yàn)獲得的 PCR 擴(kuò)增物的 TRF 峰或者從群落 DNA獲得的 16SrDNA 克隆文庫可以與預(yù)測的 TRF 峰或者系統(tǒng)發(fā)育分類進(jìn)行比較。 這些分析方法已經(jīng)被用來區(qū)分群落和研究土壤中的群落結(jié)構(gòu)和動力學(xué)。除了基于 持家基因（例如rDNA）的分析， TRFLP 也被用來分析像汞抗性基因這樣的功能基因以及微粒的甲烷單加氧酶基因。 ARDRA 是在細(xì)菌鑒定和物種水平分類方面強(qiáng)有力的一個工具，它已經(jīng)被用來分類大批的分離株 和克隆物。在 PCR 過程中通過加入熒光標(biāo)記的 dUTP 獲得的熒光 PCR 擴(kuò)增物可以直接進(jìn)行自動的 ARDRA。限制性 酶切得到的片段通過自動 DNA 測序凝膠分離。然后，酶切樣品數(shù)據(jù)與使用數(shù)據(jù)庫序列獲得的已知細(xì)菌的 rDNA 限制性分析進(jìn)行比較。 RISA 是基于 16S 和 23S rRNA 基因之間核糖體基因間隔區(qū)的長度多態(tài)性，這個間隔區(qū)的長度具有菌株或者物種特異性，通常在 50bp 到 1500bp 之間。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離。即使很相近的菌株，核糖體的非編碼間隔區(qū)大小和核苷酸序列都存在變化。這種方法成功地被用來分類菌株和指紋鑒定簡單的群落和混合的種群。 RISA的 自動版本，叫做 ARISA，它使用 熒光標(biāo)記前端引物來 PCR 擴(kuò)增內(nèi)部間隔區(qū)。然后片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)大小自動分離，它們的大小可以與 DNA 數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行比較。同時使用許多引物靶標(biāo)相同樣品中的不同的系統(tǒng)發(fā)生基團(tuán)可以評估一個群落中的不同微生物種型的種群動力學(xué)。 當(dāng)大量的 PCR 擴(kuò)增物相似性太高以致于不容易分辨時，遺傳指紋圖譜方法在區(qū)分高度多樣性的群落時就有局限。在復(fù)雜的群落中，針對群落的一部分使用引物靶標(biāo)特殊 14 基因（例如古生菌）或者微生物的功能性基團(tuán)（產(chǎn)甲烷的），可以利用基于 rRNA 的指紋圖譜技術(shù)來部分的分析群落。 根 據(jù) Gomes 等報道，區(qū)分不同的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育群體可以使用以下引物： F984GC,F27,R1378 和 R1494（細(xì)菌）和 F243HGC（放線菌）， F203α（ α變形菌） 和 F948β（ β變形菌）。特殊引物也適用于檢測特殊基因，例如類芽孢桿菌，布克氏菌和桿菌。評估真菌多樣性一直是一個問題，因?yàn)槭褂玫囊锟梢酝瑫r擴(kuò)增其他真核生物的 DNA，例如植物、水藻和線蟲類的。由 Vainio 和 Hantula 發(fā)現(xiàn)的真菌引物已經(jīng)被成功的用于研究熱帶玉米的田間和根圍土壤的真菌群落多樣性。 另外一個鑒定群落成員的方法就是應(yīng)用特別的富 集培養(yǎng)基以加快 感興趣的微生物的生長。 這種方法在研究功能性群體方面特別有效。 雜交技術(shù) 該方法是 設(shè)計出與 16S rRNA 或者 23S rRNA 序列相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸探針 ，然后 用來和 rRNA 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對。探針的特異性取決于目標(biāo)序列的變化。 通過選擇 rRNA 的保守的、可變的和超變區(qū)序列，探針可以標(biāo)記從域到亞種的不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育基團(tuán)。土壤微生物群落主要親緣型的相對豐度可以用群落 DNA 數(shù)量點(diǎn)墨雜交或者通過基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行 FISH（熒光原位雜交）。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料 標(biāo)記然后用來做環(huán)境樣品的單細(xì)胞的原位檢測 （整個細(xì)胞雜交）。 Amann和 Wagner 等提供了關(guān)于這方面的步驟和方法學(xué)的出色綜述。在probeBase 網(wǎng) 站 可 以 找 到 合 適 的 熒 光 原 位 雜 交 的 探 針（ 雜交方法可以幫助分辨群落中特殊部分（如有機(jī)群體）的物種組成。 已經(jīng)證實(shí)，通過使用系統(tǒng)發(fā)育探針， 群落指紋圖譜的點(diǎn)跡和 Southern印跡雜交 在研究群落變化和鑒定大量 的優(yōu)勢群落成員時很有效。點(diǎn)墨雜交和熒光原位雜交已經(jīng)被聯(lián)合用于區(qū)分 不同程度的金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)。 在熒光原位雜交技術(shù)中，使用落攝式熒光顯微鏡即可看到被標(biāo)記的微生物。 標(biāo)準(zhǔn)的熒光原位雜交方法存在一些缺陷，在敏感度方面它不能檢測出低核糖體含量的細(xì)胞。每個細(xì)胞的低生理活性往往與低核糖體含量有關(guān)，因此，低生長率或者餓死的細(xì)胞就有可能檢測不出來。為了克服這個缺陷，人們采用了一種 酪胺信號放大技術(shù) 用于 FISH，該技術(shù)可以分析緩慢生長的微生物。 FISH 已經(jīng)被用于鑒定不可培養(yǎng)的 微生物，研究微生物群落的分布和數(shù)量。一系列不同系統(tǒng)發(fā)育探針雜交后在顯微鏡下計數(shù)，可以確定體統(tǒng)發(fā)育群體的數(shù)量和分類學(xué)上的個體的相對分布。 克隆 rRNA 基因分析 克隆技術(shù)可以替代指紋圖譜方法 來分析 PCR 擴(kuò)增物，并且已經(jīng)被廣泛的用來分析微生物群落。從環(huán)境中獲得的 DNA通過克隆載體由 PCR擴(kuò)增 rRNA基因得到克隆文庫。 15 細(xì)菌、真菌和古生菌的 rRNA 基因通過使用區(qū)域特異性和廣泛的引物 已經(jīng)被獨(dú)立的 PCR反應(yīng)擴(kuò)增出來?？寺〉臄U(kuò)增子可以與指紋圖譜方法的進(jìn)行比較（如 ARDRA）。 然后通過系統(tǒng)發(fā)育探針點(diǎn)墨印跡雜交鑒定這些克隆。對 這些克隆的 rRNA 基因進(jìn)行測序 ， 然后與數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系。 7 使用