【正文】 1 精讀報告 原文 ： J. M. Lynch. A. Benedetti. H. Insam. M. P. Nuti .K. Smalla . V. Torsvik . P. Nannipieri. Microbial diversity in soil: ecological theories, the contribution of molecular techniques and the impact of transgenic plants and transgenic microorganisms. Biol Fertil Soils (2020) 40: 363– 385 土壤微生物多樣性：生態(tài)學理論，分子技術的應用 和轉基因植物、 轉基因微生物的影響 A. Benedetti H. Insam . Nuti V. Torsvik P. Nannipieri 摘要： 本文主要討論了三個相關主題：生態(tài)學理論在土壤 研究方面的應用，用分子生物學技術來衡量微生物多樣性以及轉基因植物、 轉基因微生物對土壤遺傳多樣性的影響。為慶祝意大利土壤科學協(xié)會成立五十周年 而 在 2020 年愛 瑞斯舉行的土壤緊急會議上討論了這些議題。 因 研究地上生態(tài)系統(tǒng)而建立的生態(tài)學理論卻忽略了地面以下的系統(tǒng)，盡管后者對于全球性的營養(yǎng)循環(huán)和地球上現(xiàn)存 的 生命很重要。土壤微生物多樣性對于很多土壤 功能具有決 定性的意義，但是在過去卻很難測定其主要成分。傳統(tǒng)的分析方法很有效 ，但是隨著分子學方法的應用，現(xiàn)在 既 可以檢測 出可培養(yǎng)又可以檢測出不可培養(yǎng)的微生物物種。 盡管 取得了一些進步，但是 土壤 微生物多樣性和土壤功能性之間的聯(lián)系仍然是一個很大的難題。 一般關于遺傳改造的細菌的 研究大部分集中在 其在環(huán)境中的留存時間、在根際的定植能力和生存能力 ，而不直接涉及微生物多樣性的問題。除了與農業(yè)實踐、季節(jié)、田地位置和年代這些相關的環(huán)境因素以外，人們開始越來越關注轉基因植物對微生物群落的影響。轉基因植物的 DNA 隨著老化或者退化的植物體 或者花粉進入土壤。 在過濾器轉化、無菌土壤中和植物中，通過在實驗室條件下重建去除抗性基因 ， 發(fā)現(xiàn)了轉基因植物的 DNA 水平轉移給了細菌。然而，人們認為在田間條件下這種轉移的頻率很低。 但必須強調的是，公眾關于轉基因植物中的抗性基因的討論不應該把注意力轉移開細菌具有抗性的真正原因，例如醫(yī)生和畜牧業(yè)中的持續(xù)濫用和過量使用抗生素。 關鍵詞： 生物多樣性； DNA；遺傳多樣性；分子學方法；多聚鏈反應 1 前言 生物多樣性是指一系列的動植 物物種，以及其遺傳物質和所屬的生態(tài)系統(tǒng)，它包括生態(tài)系統(tǒng)、 物種和基因多樣性。它是時間（進化）和空間（地理分布） 作用 的 結果 。 生態(tài)系統(tǒng)多樣性 是指棲息地、生物群落和含有各種生物生存和進化的生態(tài)系統(tǒng)的數(shù)量和豐度。生態(tài)系統(tǒng)由互相依存的物種群落以及與其相關的自然 環(huán)境所組成， 其 大小不一。物 2 種多樣性是指一定區(qū)域內的物種的數(shù)量和豐 度，并且這里的物種是指 （事實上或者潛在的） 能夠種內交配并繁殖產生形態(tài)相似的后代 的一群個體的集合。 相同物種的個體 之間無論相似或者不相似，但是對于每個物種而言，所有的個體都必須具有該物種的獨特特征。 但是 ，這個標準的定義并不適用于無性繁殖的生物（ 例如細菌和病毒 ） 。 遺傳多樣性是指一個物種內的基因和基因型的變化。它 包括 生存于地球上的所有動植物和微生物的全部遺傳信息。物種由具有不同遺傳特征的個體組成 。根據(jù)現(xiàn)代進化理論，遺傳密碼的變異性和適應性使得單個物種逐步進化并且能夠在變化的環(huán)境中生存。 諸多 土壤問題例如土壤流失、土壤退化和土壤污染等， 居于 人類在第三個一千年中為保護地球和保證人類生存必須解決的 15 個危機 之中。 雖然由于城市化發(fā) 展、侵蝕、森林采伐和污染的蔓延，每年損失上百萬公頃的土地，但是，這個問題一直 沒有受到 應有的重視 。 大量的微生物棲居于土壤中并且具有強大的代謝能力，這使得土壤成為一個十分神秘的生物學系統(tǒng)。因此， 土壤中 微生物特性往往比物理或者化學性質對人工管理和環(huán)境條件 的變化更 敏感。 土壤微生物群的組成變化對土壤功能完整性很關鍵。一篇 最近的文獻（ Nannipieri 等 .2020）綜述了土壤微生物群落、其多樣性以及其功能之間的相互關系。該文討論了像低 pH 值和污染物等環(huán)境壓力對土壤微生物多樣性和土壤功能的影響，但是未涉及轉基因生物的影 響。關于這 個問題，已經引起了一些相關的科學討 論、公眾關注和國際相關機構的參與，也有相關的 國內 或國際法律法規(guī)的建立 。 為慶祝意大利土壤科學協(xié)會成立五十周年， 2020 年我們在意大利的愛瑞斯召開了土壤緊急會議。本篇綜述即整合了許多此次會議上演講者的 投稿 。一篇有關 菌根對土壤健康和肥力影響的綜述已經作為學術論文發(fā)表。這些投稿都有一個共識，那就是 ， 當討論土壤危機 時 ，土壤 微生物多樣性 是其中的一個關鍵問題，因為土壤微生物結構和功能多樣性對土壤肥力有 影響。 本文討論了檢測土壤微生物多樣性的許多分子生物學方法 ，尤其關注分子 生物學 工具和它們在分析土壤微生物多樣性方面的巨大作用。分子生態(tài)學正在突飛猛進的發(fā)展，分子工具靶標功能基因將會彌補多樣性 結構信息和微生物活力之間的空缺，這只是時間的問題。 該文也將討論生態(tài)學理論在土壤研究中的應用，盡管這些理論一般只適用于地上系統(tǒng)，但是由于微生態(tài)概念的發(fā)展這些顯得日益重要。本文討論的其他方面有揭露土壤微生物對轉基因生物的影響，因為人們越來越關注轉基因生物在開放性環(huán)境中的使用，例如農業(yè)土壤。在這點上， 有關轉基因 DNA 在土壤中殘留的研究已經考慮到與植物相關的細菌與轉基因 DNA 之間的轉化。 2 土壤微生物多 樣性和功能多樣性和生態(tài)學理論的作用 迄今為止 ， 生態(tài)學理論一直致力于研究地上系統(tǒng)。盡管土壤微生物通過營養(yǎng)循環(huán)、分解作用和能量循環(huán)在生態(tài)系統(tǒng)功能扮演著很重要的角色，土壤體系忽略了當代生態(tài)學理論的發(fā)展。在此 ， 我 們討論土壤微生物研究如何促進生態(tài)學理論的發(fā)展，反過來這些理論又將 如何促進我們更好的了解地下系統(tǒng)。 3 微生物多樣性通常被認為是不同分類的生物個體的數(shù)量以及它們在分類學中的分布。本文將此概念擴大，在生物 變型級別以下用高流量分析或者整體性的工具來評估個體多樣性。這包括在 基因組學和蛋白組學水平上通過獲得活體信息成像來 研究個體細胞。整體 性的工具也適用于研究單個微生物細胞和群落相對于環(huán)境的功能多樣性。這個延伸的觀點似乎更適合于土壤環(huán)境的復雜性。 ShannonWeaver 指數(shù)（ H’） 通常以以下形式使用： H’=Σ(ni/N)log(ni/N)=Σpi(logpi) 根據(jù) Odum 的觀點 ， ni是指 每個物種的重要值， N 是指總的重要值， ni是指每個物種的重要性概率（ ni/N）。 這樣 ， H’把 多樣性的豐富度和平等度成分都考慮在內。 就群落水平生理學成像而言，可操作單元物種被可操作單元能力替代，以降低某一化合物。 在景觀水平上來講， 人們對多樣性的定義有不同的看法。 Whittaker 建議將 某一生活環(huán)境 的群落 的物種多樣性（ α多樣性），比率、 物種變化隨生活環(huán)境梯度變化的程度（ β多樣性） 和同一系列生活環(huán)境的物種豐 度（ γ多樣性）區(qū)分開來。從傳統(tǒng) 的生境多樣性來看 似乎合理，所以這個概念也可能用于描述土壤微生物多樣性的概念。然而，土壤生物量 被界定為一種三維立體多樣性，包括根圍和絕大部分土壤、大團聚體和微小聚體、大孔徑和小孔徑以及不同范圍等之間的可能性差異（圖一）。事實上，在一塊土壤中，有許多的微生境，例如根際、根圍、碎石、腐殖質或大塊土壤。土壤 在很大程度上是典型的巨大的分層生境，有不同水平層次的 范圍，每一個范圍都可以視為一個獨立的整體?，F(xiàn)在仍然不知道這些微生境多樣性是如何并入土壤整體的多樣性的。 圖 1 根據(jù) Whittaker 的觀點，生態(tài)系統(tǒng)多樣性必須在不同的水平進行觀察：一個棲息群落的 物種多樣性（ α多樣性）；隨棲息地梯度變化物種變化的速率和程度（ β多樣性）；一系列棲息地的物種豐度（ γ多樣性）。另外，在土壤中，多樣性的空間變化跟根圍和大塊土、大塊土壤和顆粒土壤、大孔隙和小孔隙和不同的范圍等有著很重要的關系 我們 都知道有很多因素會影響多樣性 ，至少在理論上會影響。這些因素有食物 關系、生活環(huán)境時間和空間的差異、干擾和富營養(yǎng)化。其中有消極的作用如壓力，積極的作用如資源多樣性或生物之間的相互影響（圖二）。 對多樣性的積極影響可以增加土壤微生物的穩(wěn)定性、彈力、抵抗力甚至生產力。 4 圖 2 外界因素決定多樣性，反過來影響生態(tài)系統(tǒng) 特性，像穩(wěn)定性、抵抗力、豐富度和生產力 生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相關 理論 的出現(xiàn) 已經有近 50 年了，并且被認為是早期生態(tài)學理論的核心法則。 MacArthur 在 1995 年發(fā)表的一篇關于動物種群波動和穩(wěn)定性衡量的文獻中假設，群落穩(wěn)定性將 會隨著食物網的結構而增加，而不是某一物種的個體生態(tài)學特性。 其 前提是 ， 在一個具有大量能量途徑的生態(tài)系統(tǒng)中單一物種的數(shù)量變化對其它物種的影響要比 在一個能量途徑少的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生相同變化時的影響要小。MacArthur 使用 了一個簡單的食物網模型來說明多樣性對穩(wěn)定性的影響，并且突然改變一個群落成員的數(shù)量作為干擾。他對穩(wěn)定性的定義就是依據(jù)群落抵抗外界某一干擾的能力（圖 3）。 May挑戰(zhàn) MacArthur 的假設并且說明這種干擾應該是絕對值 ，在這種情況下兩個群落對于干擾的敏感程度是相同的。由于支持競爭性假設的實驗證據(jù)仍然存 有異議，所以 30 年后這場爭論依然沒有解決。 圖 3 MacArthur(1995，左 )的食物網模型， May(1973,右 )的。 MacArthur 假設當一個低多樣性（ L）的群落（這里，兩個成員）在受到外界干擾，如一個群落成員減少 50%，這種干擾比對一個高多樣性的群落（ H,20 個物種）來說影響要大。所以，高多樣性的群落會更加穩(wěn)定。根據(jù)的 May 的觀點，干擾應該用絕對值，這樣的話這兩個群落對于干擾受到的影響都是相同的。 自從 MacArthur 的食物網模型出現(xiàn)后，人們提出了許多的生態(tài)學理論或者模型來解釋多樣性 穩(wěn)定 性或者多樣性 生產力之間的關系。我們將討論其中的資源不均一性假設和保險假設。 資源不均一性 假說 該假設說明 當一個區(qū)域在資源可利用性方面均一的貧瘠時，它將很難保持許多物種 5 并且它的生產力也將很低（圖 4）。 該假設認為，隨著生境的平均質量的提高，資源的空間變化性和多樣性也將增加，因此導致生產力和多樣性增加。 然而，超過某一點，恰恰相反，資源不均一性和多樣性會減少。這是因為在這種條件下具有優(yōu)勢的物種在各處有利的小生境中都會受到偏愛。 圖 4 資源不均一性假說 （ Tilman 1982），在地域、區(qū)域和全球規(guī)模的角度。 比如說， Hall 等發(fā)現(xiàn) 資源不均一性和植物多樣性之間存在一種駝背 形的關系。但是，這種駝背形的關系僅僅適用于局部的和區(qū)域性的規(guī)模，當在全球規(guī)模水平時 ， 能源 豐富度關系隨著能源單調遞增。微生物多樣性和能源之間的關系尚不清楚，但是， 從 許多植物的特定微生物群 看來，由于微生物的資源不均一性增加所導致的植物多樣性的增加，微生物多樣性也會隨著增加。 保險假說 根據(jù)保險假說，通過抵抗干擾的緩沖效應（減少當前生產力變化）和性能增強效應（ 增加當前平均生產力 ），物種豐富度對生態(tài)系統(tǒng)生產力 產生 正面的影響 。這種效應是由單個物種對波動的 反應、反應的非同步性程度和反應的具體形式所決定。由此推知，特別是在像季節(jié)性的干旱或者溫度周期性變化等這些外部因素變化強烈的氣候區(qū)，多樣性顯得很重要。那些在機能上冗余的物種隨著時間的變化 也不再有很多。 Griffiths 等證實，當土壤微生物多樣性很低時，面對短時間的壓力（短時間 40℃ ）微生物功能性恢復受到消極的影響。在另一方面，在持久的壓力時沒有發(fā)現(xiàn)任何的恢復；但是對于持久的壓力微生物多樣性高的土壤比低的抵抗力要好。 生態(tài)系統(tǒng)有兩大特性：結構和功能。植物和動物水平的結構比土壤微生物水平的結構要明顯。 是不是 知道誰 在負責 有機物的降解很重要呢？或者說能不能充分的確定大量的生