【正文】 。這種結(jié)合的方法可以更好的理解微生物多樣性和土壤功能之間的聯(lián)系。必須強調(diào)的是，公眾對于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的爭 論并不能轉(zhuǎn)移人們對于引起細菌產(chǎn)生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過量使用抗生素。關(guān)于抗性基因從轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到細菌的觀察有相矛盾的結(jié)果。 轉(zhuǎn)基因的 DNA 在植物衰老過程中會被植物核酸酶降解，或者在微生物降解土壤中殘留的植物時被降解。 一般情況下轉(zhuǎn)基因植物并不會影響細菌群的組成，并且即使當觀察到有影響時，它們也與自然變動無關(guān)。測定限制整個土壤代謝速率的反應(yīng)速率可以減少實驗的工作量，并且不會影響評估土壤代謝活力。 或許檢測主要物種 組成的變化 更有價值，例如 硝化細菌， 只負責土壤生化過程的一部分，像自生固氮菌。 當然，這不適用于特殊的功能。 盡管使用分子生物方法可以 較好的鑒定土壤中微生物多樣性，但是關(guān)于微生物多樣性和土壤功能性之間的關(guān)系仍然不是很清楚。 May等沒有把這種理論應(yīng)用于微生物群落，但是這不能說明它不適用。 May等使用數(shù)學模型證明，隨著相互影響的物種數(shù)量的增加，整個系統(tǒng)的穩(wěn)定性會降低，除非遇到特殊的條件。所以，公眾對于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的爭論并不能轉(zhuǎn)移人們對于引起細菌產(chǎn)生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過量使用抗生素。 事實上：（ 1）通常位于遺傳移動元件上抗性基因在細菌種群間廣泛的存在；（ 2）轉(zhuǎn)基因植物和細菌之間的水平基因轉(zhuǎn)移被認為概率極低 ， 并且在田間條件下檢測不到，因此說明，似乎使用具有抗性基因的植物并不會嚴重的影響抗性基因在細菌之間的擴散。細菌本身的遺傳可 塑性是抗生素抗性出現(xiàn)的一個很大的原因。 在不同的環(huán)境之間存在大量的抗性基因和抗性細菌的移動。從污泥、糞便、河水到土壤中的細菌，關(guān)于使用最廣泛的標記基因 nptII 基因的擴散的研究證實， 在高比例的卡那霉素抗性的腸道細菌內(nèi)，抗性是由 nptII 基因編碼的。因 22 為細菌可以在不同的環(huán)境和不同的地理區(qū)域之間傳播，人們需要獲得 細菌抗性的全球性流行的 數(shù)據(jù)，選擇和擴散比以前有了更加廣泛的途徑。 由于人類大規(guī)模的使用抗生素，導致細菌抗性的出現(xiàn)并且快速的發(fā)展。與此相比，報道較多的是不同環(huán)境條件下結(jié)合或 者運用 水平基因轉(zhuǎn)移 。 用來刺激 Aciobacter 種群轉(zhuǎn)化能力的營養(yǎng)溶液包含無機鹽和簡單的復合物，這相當于根圍分泌物。在關(guān)于轉(zhuǎn)化的絕大多數(shù)研究中，有能力的細菌已經(jīng)被加入到被研究的土壤中去了。 現(xiàn)在關(guān)于自然轉(zhuǎn)化過程的不同步驟已經(jīng)研究得很透徹了，從細胞 DNA 的釋放到它的留存到它被有能 力的細菌整合的可用性。在同源 DNA 存在的情況下，通過自然轉(zhuǎn)化來進行基因轉(zhuǎn)移的研究顯示，當攻擊性的同源出現(xiàn)時 ，非同源遺傳材料的附加整合才會發(fā)生。據(jù)作者估計，是因為非無菌土壤中的轉(zhuǎn)化株的數(shù)量在 1010到 1011之間，這個數(shù)值低于可以檢測到的范圍。 與染色體或者質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化相比，當起始就過濾轉(zhuǎn)化 Aciobacter 的實驗更深一步并且在無菌和非無菌土壤中進行時，與植物 DNA 或植物勻漿之間的轉(zhuǎn)化頻率會劇烈的下降。一個關(guān)于 從轉(zhuǎn)基因植物到細菌之間發(fā)生 抗性基因的水平轉(zhuǎn)移的 新發(fā)現(xiàn)是通過用細菌的同源重組從轉(zhuǎn)基因植物中捕獲 DNA。已經(jīng)證實當感染青枯病菌的番茄被灌輸質(zhì)粒DNA 或者被攜帶不同遺傳標記的青枯病菌共同 感染時會發(fā)生基因交換。這兩項研究都得出了相同的結(jié)果，即 Aciobacter 被轉(zhuǎn)化了并且內(nèi)部被切除的 nptII 基因作為同源序列和偵測系統(tǒng)（導致具有卡那霉素抗性的 nptII 基因整合）。還觀察到，不僅轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 而且轉(zhuǎn)基因植物的勻漿都修復了 317bp 的刪除，這將導致具有抗卡那霉素特性的 Aciobacter 的出現(xiàn)。許多人 之所以 沒有檢測到轉(zhuǎn)基因植物和細菌之間的水平基因轉(zhuǎn) 移，大概是因為細菌中缺 21 少同源序列或者使用了低轉(zhuǎn)化率的細菌。直到現(xiàn)在，人們都沒有弄清楚細菌是否可以被植物 DNA 所轉(zhuǎn)化。與前面的研究相比， De Vries 等運用一種新的特殊的生物監(jiān)測技術(shù)發(fā)現(xiàn)田間土壤中的轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 最長可以留存達四年。 在田間種植的轉(zhuǎn)基因馬 鈴薯的根圍經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)表達 T4 熔解酵素的馬鈴薯的重組DNA。但是，實測到轉(zhuǎn)基因植物 DNA 卻可以躲過這些降解過程。 在土壤微生境下運用自由的轉(zhuǎn)基因 DNA 進行相似的實驗，也說明其可以長久的留存。為檢測 DNA 而不依賴于培養(yǎng)方法，他們直接從土壤中提取總?cè)郝?DNA，然后選用三個針對轉(zhuǎn)基因 DNA 的不同的特殊引物來進行擴增。 這兩種因素對土壤微生物活性都具有重要的影響。不同的研究也發(fā)現(xiàn)在微生境和田間條件下轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 有長時間的留存。微生物活力被 認為是影響土壤中自由 DNA 留存的重要生物因素，因為微生物活力受刺激經(jīng)常引起 DNA 酶活力隨著增加。有人假設(shè)微生物或者 腐敗的植物組織釋放的自由 DNA 可以作為養(yǎng)料或者自生性細菌的遺傳信息儲藏庫。目前，眾多 課題組 對于環(huán)境條件下的自然轉(zhuǎn)化 主要有兩方面： （ 1）自由 DNA 可以持續(xù)多長時間，例如在土 壤中；這些 DNA 依然可用于自然變換么？ （ 2） 在環(huán)境條件下不同的細菌物種有多少能達到可以自然變換的狀態(tài)？ 實驗室條件下發(fā)現(xiàn)了基因的瞬間轉(zhuǎn)移，這提供了理解植物 DNA 轉(zhuǎn)化到細菌中的另外一條可能途徑。 自然轉(zhuǎn)化 的前提是，可用的自由 DNA；競爭性的生長；獲取并穩(wěn)定的整合捕獲的 DNA。實驗證明，大于 40 個來自不同環(huán)境的細菌物種是可以發(fā)生自然轉(zhuǎn)化 的。細菌獲得的單鏈 DNA或者通過 同源重組被整合進細菌的基因組，或者形成一個自 動復制元件。） 10 土壤中 DNA 的留存和轉(zhuǎn)基因植物 DNA 與細菌之間的橫向轉(zhuǎn)移 自然轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)基因植物基因與細菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的最可能機制。 轉(zhuǎn)基因植物對于土壤微生物群落的影響比在季節(jié)和田間位置等環(huán)境因素下的影響似乎更相關(guān)。 在其他的溫室條件下的研究中 報道了轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物和過程的瞬時的影響。但是，鑒定許多的分離菌需要對馬鈴薯不同行之間進行統(tǒng)計性的分析。盡管只有細菌群落中的一小部分與 Biolog類型有關(guān)，但是細菌群落的分解代謝潛能的差異可以定性定量的檢測出來。因此，轉(zhuǎn)基因?qū)τ诩毦郝涞挠绊戯L險似乎比原來預 見的要低。在此項研究中， 所有的方法都顯示是與植物生長階段、田間位置或者季節(jié)相關(guān)的環(huán)境因素影響根圍群落，而不是轉(zhuǎn)基因植物表達的 T4 熔解酵素。第三種方法是基于擴增總根圍 DNA 的 16S rRNA 基因片段然后進行 DGGE 分析或者克隆和測序。在第一種方法中，根圍細菌種類的相對豐度的檢測是基于培養(yǎng)方法，然后用脂肪酸方法分析每個孤立群的特性。產(chǎn) T4 熔解酵素兩排，一排是沒有 T4 熔解酵素基因的和另一排 父本，在兩個相距很遠的田間位置和不同的土壤類型的情況下，連續(xù)觀察了 3 年多。ring和 Mahn將遺傳改造目標改為細菌，發(fā)現(xiàn)與植物相關(guān)的細菌確實受到了影響， 至于易受轉(zhuǎn)基因馬鈴薯影響的 胡蘿卜軟腐歐文氏菌 明顯的減少了。 Heuer 等研究了田間條件下馬鈴薯根圍細菌群落的結(jié)構(gòu)和動力學特性，并且與轉(zhuǎn)基因的表達 T4熔解酵素的馬鈴薯植株做了比較。 其他變種 19 的差異似乎主要是由土壤類型的影響。在 Dunfield 和 Germida 的研究中，他們在加拿大四個不同的地區(qū)分別種植了四種耐除草劑的和四種常規(guī)的 油籽，然后用 FAME 和 Biolog CLPP 來分析其兩季的根圍土壤群落特性。 通常人們檢測不同的轉(zhuǎn)化水平，由于這樣可以看出基因表達水平和穩(wěn)定性的變化。 為了檢測轉(zhuǎn)基因的影響 ，田間試驗是在隨機選擇的大田種植轉(zhuǎn)基因植物，并且在不同的點設(shè)置未遺傳改造的父本作為對照。 最近，人們報道了很多研究，他們使用了分子指紋圖譜技術(shù)來分析植物生 長過程中根圍的動力學和植物物種對根圍相關(guān)的細菌群落 豐富度的影響，觀察到在植物生長過程中根圍微生物群落的相關(guān)豐 度發(fā)生巨大的變化。如前所述，基于核苷酸分析微生物群落可以克服培養(yǎng)方法的缺陷。值得一提的是，如果遺傳改造是為了提高植物對細菌或者真菌病原菌的抵抗力而釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如細胞壁溶解酶或者像 T4 溶解酵素的化合物、幾丁質(zhì)酶或者抗菌肽等，那么就不能排除土壤微生物群落未知的改變，因此應(yīng)該進行評估。 第一種推測可能影響植物健康或者土壤功能，第二種推測 帶來的影響比較間接 ——標記基因的水平轉(zhuǎn)移，主要 是看這種水平轉(zhuǎn)移對于這些基因擴散到其他細菌群落的影響程度。 是不是人們覺得轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物種群的影響可以忽略，或者說至少與其他轉(zhuǎn)基因生物安全性 18 問題相比不是很重要，例如抑制雜草物種、對非靶標生物的影 響或者新的病毒的出現(xiàn)。 9 轉(zhuǎn)基因植物對微生物群落的影響 過去的十年中人們使用了大量的轉(zhuǎn)基因植物，并且許多轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被商品化。 在過去的二十年中，科學知識有了長足的進步，可以更加精確地跟蹤環(huán)境中的微生物并且可以在物種和菌株水平進行鑒定。 為了保護農(nóng)民和更加容易的控制或者國際機構(gòu)或相關(guān)當局監(jiān)測，有一個確定一致的國際性的立法將會很有益的。 當引入的細菌數(shù)量相對較高時，主要的影響發(fā)生在田間試驗的初期；轉(zhuǎn)基因微生物對真菌種群的組成比 WCS358r 的影響時間要持久。 然而，關(guān)于接種轉(zhuǎn)基因微生物的影響并沒有直接涉及微生物多樣性的問題，大多數(shù)集中于其他風險 評估方面的，例如它們在環(huán)境中的抵抗力和根圍的定植能力。其中使用的一個主要方法是檢測加入構(gòu)建的和原來的細菌群以后對根圍、土壤酶 N乙酰氨基葡糖苷酶 、果膠酶、酸和堿性磷酸酶、磷酸二酯酶、 芳基硫酸酯酶 和尿酶，這些酶在土壤的 C、 N、 P 和 S 的循環(huán)中起著重要的作用。為了作比較，把菌株 F113G22 進行改造以產(chǎn)生Tn5::lacZY 不產(chǎn)生 DAPG 的衍生的 F133，此菌株沒有阻止植物病原菌真菌生長的能力。 就功能基因而言，分離自甜菜的熒光假單胞桿菌 F113 菌株能產(chǎn)生抗生素 DAPG。但是卡那霉素抗性不影響生物適應(yīng)性，其他的兩種標記則減少了生態(tài)競爭力。 結(jié)果顯示沒有標記基因的運動，對于原來的群落只有小的 瞬間的影響。 熒光假單胞桿菌 SBW25， 分離自甜菜葉面，很容易定植于甜菜的根圍、葉面和小麥的根圍。其他的微生物制劑有應(yīng)用潛力的現(xiàn)在主要有 生物修復和植物修復、磷酸鹽增溶、土壤集聚、污物處理、生物浸取、油恢復、 煤炭擦洗和生產(chǎn)生物氣體。對于縮寫，見圖 7 8 轉(zhuǎn)基因微生物對微生物群落的影響 微生物接種菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中已經(jīng)應(yīng)用超過每年 3 億公頃，其中的一些有歷史安全使用記錄的始于 1896 年（知名的根瘤菌，用來接種豆科植物）或者 19 世紀 30 年代（例如蘇 云金芽孢桿菌，用來生物防治無脊椎害蟲）。沒有污染的空白對照土壤也用熒光原位雜交測定。 圖 9 低濃度和高濃度金屬污染的污泥土壤群落結(jié)構(gòu)變化。污染會導致土壤群落結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的變化。 這些調(diào)查顯示，在相對干擾和污染較少的土壤中的總微生物多樣性很高，然而經(jīng)過干擾和污染的土壤中的總微生物多樣性卻劇烈的減少。因此，這是兩種土壤中最大的孤立群體。 在重度金 16 屬污染土壤中， α變形菌的克隆在數(shù)量上占有優(yōu)勢 （圖 9） 。低金屬污染的土壤中嗜纖維素菌 屈撓桿菌 似細菌群體數(shù)量最為豐富。 這些探針適用于總細菌群落（ FISH），細菌單體和基于 PCR的 16S rRNA克隆文庫（空位印跡雜交）。低濃度和高濃度的金屬污染的土壤 DNA 豐富度分別是 1010bp 和 109bp，分別相當于大約 4600 個和 1500 個像大腸桿菌一樣的基因組。這相當于大約 9800 個具有大腸桿菌基因組大小的不同細菌基因組。 由各種技術(shù)得出的無污染的污泥改良的土壤微生物多樣性與 （ 低和高的金屬濃度 ）金屬污染 許多年 的污泥處理的田間土壤比較，一方面， 這三種處理得出的堿基組成很相似；另一方面， 由 DNA:DNA 重聯(lián)檢測出的總遺傳多樣性是不同的。 由于含有一定數(shù)量的優(yōu)勢菌群和并且許多只是低豐度，耕種土壤的菌群可能要比牧地土壤的 分布更加不均勻。由此可見，耕種土壤的總遺傳多樣性大概比相對沒有受干擾的土壤低 24 倍，并且整個的遺傳多樣性提供了一個很好的由農(nóng)業(yè)管理引起的干擾指標。 重新組合的技術(shù)顯示，根據(jù) C0t1/2值計算，微生物群落 DNA 的復雜性 在適于耕種的土壤中大概是 109bp，有機土壤中大概是1010bp。 有上述相關(guān)技術(shù)