臨床微生物檢測(cè)的基因同源性分析(參考版)
2025-04-07 23:08本頁面
【正文】 。 電泳后DNA樣品染色，采用0．5ug／mlEB浸泡30～45min，紫外燈下觀察拍照。通常情況下，電泳宜在5～15℃的低溫條件下進(jìn)行；電泳緩沖液應(yīng)在兩極槽之間循環(huán)；而且低電壓能產(chǎn)生較整齊的條帶；交變電場(chǎng)的交叉角度越大分離效果越好。在OFAGE中對(duì)于20cm20cm的凝膠，選擇330V以上的電壓，在0．5XTBE中的電流為100—200mA，以達(dá)到IOV／cm的電壓。 凝膠中瓊脂糖的濃度一般為o．8％～1．5％，常用1％。 三、PFGE的電泳條件 (二)反轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳 正交交變電場(chǎng)凝膠電泳(orthogonal fieldalternatinggelelectrophoresis，OFAGE)，兩交變電場(chǎng)的電流方向相互垂直。 為了增強(qiáng)PFGE對(duì)大小差異較大的DNA樣品的分辨率，可采用交變脈沖梯度電場(chǎng)，即在電泳過程中，先用較短的交變脈沖時(shí)間使較小的DNA分子分離，然后用較長(zhǎng)的交變脈沖時(shí)間分離較大的DNA分子。根據(jù)被分離DNA分子的范圍選擇適當(dāng)?shù)拿}沖時(shí)間，經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間不斷變形轉(zhuǎn)向泳動(dòng)，不同大小的DNA就被分離。線性分子改變形狀和泳動(dòng)方向所需時(shí)間與其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差異作為分離不同DNA分子的依據(jù)。在交變脈沖電場(chǎng)中，大分子量線性DNA改變泳動(dòng)方向所需時(shí)間比小分子線性DNA要長(zhǎng)，因?yàn)榍罢咦冃文芰Φ陀诤笳摺?脈沖電泳分離DNA大分子的介質(zhì)是瓊脂糖，大于20kb的線性DNA雙鏈片段，在瓊脂糖凝膠的網(wǎng)孔中的泳動(dòng)，就像蛇行似的尋找彎曲蜿蜒的孔隙。 一、PFGE的基本原理脈沖場(chǎng)凝膠電泳1984年，Schwartz和Centor發(fā)明了交變脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsedfield gel electrophoresis，PFGE)技術(shù)，與常規(guī)的直流單向電場(chǎng)凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1s到5min左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。在任何一種分析系統(tǒng)中，一個(gè)單一遺傳事件(如單個(gè)代謝酶的變化或者一條電泳條帶的變化)組成的改變，不足以得出兩個(gè)菌株代表不同菌株的結(jié)論，也就是說它們不一定在流行病學(xué)上無關(guān)。隨著越來越多的分子技術(shù)應(yīng)用到醫(yī)院感染的病原菌研究中，為流行病學(xué)調(diào)查和患者的治療提供了快捷準(zhǔn)確的支持。
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