【正文】 化途徑是否在正常進行？如果是這樣的話，那么功能多樣性將比結(jié)構多樣性更加重要。但是有一種共識就是 恒定的環(huán)境下極少數(shù)的物種對于生態(tài)系統(tǒng)功能是必需的，在變化的環(huán)境下大量的物種對于維持生態(tài)系統(tǒng)過程 穩(wěn)定性 很有必要。根據(jù) Giller 等， 如果微生物多樣性改變后，土壤微生物的有用的冗余程度將會導致對土壤微生物群落沒有影響。如果大量的物種負責簡單的功能，任何物種的消失對于土壤過程都不會有任何的影響，因為其他的有機體會填充這個功能空隙。當然 ， 這對于特殊的功能是不使用的， 例如線蟲能抵抗燕麥全蝕病菌。 這種功能只屬于單個物種（熒光假單胞桿菌）并且取決于單一的功能 —— 產(chǎn)生 2， 4DAPG。 6 3 土壤功能性 許多方法 可以用來 檢測土壤中的微生物過程或者酶反應速率。絕大多數(shù)方法得出的是可能 的活力 ， 而不是真實的，因為實驗是在充足的底物濃度、最優(yōu)的 pH 值、溫度值和通常在土壤泥漿里 的條件下進行 。 而原來 pH 值和底物濃度并不是最優(yōu)的，并且溫度和濕度在浮動變化。用 14C 標記的化合物監(jiān)測 C 氧化為 CO2或者用 15N 富集的化合物監(jiān)測土壤中 15N 的分布， 具有代表性的這兩個例子可以提供土壤生物過程的數(shù)量分析。Nannipieri 等討論了例如土壤呼吸、酶活力、硝化作用等傳統(tǒng)方法的優(yōu)點和不足。 在土壤生態(tài)學中變得日益重要的一個有效方法就是 CLPP（群落水平生理學模型）。這種方法采用了包含 95 種 C 源的微平板。 一個微生物群落對它的利用方式可以潛在的提供這個群落的功能信息，也可以獲得多樣性參數(shù)，例如 H’或者分解代謝的多功能性。但是， 這種方法有許多的缺點，它是培養(yǎng)基依賴性的，并且隨著培養(yǎng)微生物群落結(jié)構的組成會發(fā)生變化。此外，用這種方法不能檢測出真菌對土壤功能的作用。 Degens 和 Harris在測量土壤微生物群落對這些化合物 的利用方式時使用了土壤短期反應方法，并且加入了氨基酸、 羧酸、碳水化合物和有機物（底物誘導呼吸）以克服上述缺陷（圖 5）。 圖 5 地表植物 對于土壤微生物群的代謝平均度的影響 一個長期爭論的問題是 ： 多樣性是否與生產(chǎn)力相關，特別是植物產(chǎn)量。 CLPP 方法得出的數(shù)據(jù)經(jīng)常被用于表示土壤功能多樣性。 Yan等發(fā)現(xiàn)有機 C 和功能多樣性之間存在一個斷棍的關系，并且他們也重新計算了 Sharma 等給出的數(shù)據(jù)，該作者曾經(jīng)說發(fā)現(xiàn)了H’和微生物生物量 之間存在線性關系。在那種情況下，斷棍模型給出了最好的解釋（圖6）。 圖 6 到了某個頂 點，功能多樣性（ H’）隨著土壤中微生物量和 /或有機 C 的增加而 單調(diào)遞增。數(shù)據(jù)來自 Yan 等（ 2020，圓圈 ）和 Sharma 等（ 1997，黑點 ） 7 從這些數(shù)據(jù)可以看出，在某一特定的臨界值以前（例如 %有機 C），功能多樣性隨土壤微生物生物量單調(diào)遞增。 4 檢測微生物多樣性的分子生物學方法 土壤微生物多樣性通常都是由像可行的培養(yǎng)方法、 CLPP 和流式細胞儀等這些方法來分析。這些方法有很多的不足。一個強有力的證據(jù)就是當在顯微鏡下觀察土壤細菌時 ，看到的大部分是活的 ， 但是在瓊脂平板上卻不能形成可見的菌落。 但是 ， 取自環(huán)境中的樣品無論是可培養(yǎng)的還是不可培養(yǎng)的微生物都可以用基于提取、純化和核苷酸特性的分子技術來鑒定。這些技術提供了一種更加精確的土壤微生物多樣性程度衡量方法。 這些微生物核苷酸信息可以用來觀察和比較不同系統(tǒng)水平的多樣性，從物種變化到群落多樣性都可以。這一部分綜述了現(xiàn)在研究土壤微生物群落的一些分子學方法的潛力和缺陷。為了說明分子方法的有效性和簡便性，文章中給出了它們在研究本地有關受污染和干擾的土壤微生物群落的 一些 具體應用的例子 （圖 7） 。 圖 7 縱覽分析微生物群落的非培養(yǎng)的分子生物方法。 PCR 聚合鏈反應， DGGE 變性梯 度凝膠電泳， SSCP 單鏈構象多態(tài)性， TRFLP 末端限制性片段電泳， RISA 基因間隔區(qū)分析， %G+C 摩爾 %鳥嘌呤 +胞嘧啶 從微生物群落獲得的總基因組 DNA（元基因組）可以提供全部群落結(jié)構和總遺傳多樣性的補充信息。例如， 細菌人工染色體載體可以用來直接從土壤微生物群落中克隆大片段的 DNA。 通過高和低的分辨率 ， 細菌人工染色體文庫可以用來在系統(tǒng)發(fā)生和功能水平上研究土壤微生物多樣性。 中等分辨率的 方法包括系統(tǒng)發(fā)育探針的應用，或者是群落 DNA 或者 RNA 的空位或者點墨法雜交，或者是完整的細胞熒光原位雜交。 這些方法可以用 來確定目標微生物的數(shù)量和測定微生物群落的全部的分類學組成。 其他的中等分辨率的 方法是基于保守基因的序列差異，例如編碼的核糖體 RNA、所謂的 rDNA。這些指紋識別方法相同的地方是都使用了 PCR 來特異擴增目標核苷酸。 8 擴增的結(jié)果或者用來限制性分析或者基于變性或構象性質(zhì)進行分離。 rRNA 或者 rDNA的限制性分析 [擴增核糖體 DNA 限制性分析（ ARDRA）；末端限制性片段電泳（ TRFLP） ]可以在高水平的分類學等級進行區(qū)分，甚至可以鑒別到種。 Osborn等曾發(fā)現(xiàn) rRNA 的基因的 TRFLP 的峰可以用來區(qū)分鞘氨醇單胞菌 屬的物種。他們認為，從整個群落和（或）分離的或克隆得到的峰通過與預先存儲的 TRF 片段的數(shù)據(jù)庫進行比較，可以直接鑒定峰中的某些片段 在分類學中的位置。 TRFLP 和群落指紋印跡技術 [變性 /溫度梯度凝膠電泳（ DGGE/TGGE）；單鏈結(jié)構多態(tài)性（ SSCP） ]，這些基于分離 PCR 擴增的 rRNA 和rDNA 分子的技術已經(jīng)被成功的用來分析微生物群落的結(jié)構和動力學。 高等分辨率的方法包括非編碼 DNA 區(qū)域的指紋識別（例如 repPCR擴增重復性序列）和 編碼區(qū)及 非編碼區(qū)的測序。這些方法適合于在種和亞種的水平上區(qū)別和鑒定微生物菌株。 高分辨率的指紋識別方法也已經(jīng)被用于監(jiān)測微生物群落的特殊種群和評估細菌群體和克隆基因的多樣性。 5 用總基因組 DNA 方法來分析生物多樣性 土壤微生物群落的組成情況可以通過檢測群落 DNA 的堿基差異 [摩爾 %鳥嘌呤 +胞嘧啶（ %G+C） ]來獲得。這個由熱變性即可測定，因為單鏈 DNA 比雙鏈 DNA 在 260nm的吸光能力大概高 35%。用一個恒溫的試管在慢慢加熱的條件下 ,通過紫外分光光度計測定 260nm 處的吸光度來檢測 DNA 的解鏈。解鏈曲線轉(zhuǎn)化成 %G+C 的峰，以此來提供微生物群落的峰，從而能夠指示整個的遺傳多樣性。即使 這種方法被認為分辨率很低，但是它可以用來指示整個微生物群落結(jié)構的整個變化，尤其是多樣性很低的情況。 DNA堿基組成曲線圖也可以通過笨亞甲胺 DNA 復合物在氯化銫梯度下等密度梯度離心來獲得。 雙苯酰亞胺優(yōu)先與 AT 堿基對結(jié)合，這會使 DNA 的浮力密度降低。因此，根據(jù)堿基組成通過雙苯酰亞胺密度梯度離心可以將群落 DNA 分離開來。這種方法有一個缺陷 ,就是兩個具有相似堿基差異的群落不一定有相似的物種組成，這是因為不同的物種經(jīng)常有相似的堿基組成。從另外一方面來說，如果群落之間有不同的堿基差異，這可以有力的說明它們之間物種組成 是不同的。因此，這個方法可以用來大致的反應干擾條件下微生物群落組成的變化。雙苯酰亞胺 氯化銫梯度超離心分離得到的群落 DNA 片段可以結(jié)合分子生物方法來進一步分析不同的 G+C%含量，例如 PCR 和 DGGE。這種方法的一個優(yōu)點是在 沒有被 檢測和分析 到 片段的情況下 ，群落中的一些非優(yōu)勢微生物通過 PCR就可能檢測不出來。 從微生物群落分離出來的 DNA 復雜性是對總遺傳多樣性的一個估計。當在低于其解鏈點溫度大概 25℃ 時單鏈 DNA 再退火，變性的比率就指示這個遺傳復雜性。隨著DNA 復雜性的提高或者溶液中不同 DNA 型 的數(shù)量，變性比率 會下降。重聯(lián)的 DNA 部分可以通過 C0t 值 來反映，其中 C0是指摩爾核苷酸每升， t 是指以秒計算的時間。 C0t1/2（ 50%DNA 重聯(lián)時 ）用來估計 DNA 的復雜性 。 圖 8 給出了一個適于耕種土壤中微生境 9 群落 DNA的 C0t 曲線的 例子。土壤微生境或者是埋于甲烷氣體環(huán)境下以此為 C源（ CH），或者是在厭氧條件 下 （ N2） 。 用 未處理的天然土壤作為對照。由于復雜性已知 [ 106堿基對 （ bp） ]， B 基因組 DNA 的重聯(lián)速率作為標準曲線（表 1）。為了估計土壤群落 DNA 的大小，使群落 DNA 的 C0t1/2除以 B 基因組 DNA 的 C0t1/2， 然后再乘以 B 基因組 的大小。 重連結(jié)果顯示干擾減少了微生物多樣性（圖 8，表 2）。 未受干擾的土壤 DNA 其C0t1/2 值 是 6300 摩爾每秒每升，相當于大約 8000 個不同的大腸桿菌基因組。氮氣和甲烷影響的土壤 DNA 的 C0t1/2值 分別減少到了 2500 摩爾每秒每升和 300 摩爾每秒每升。這分別相當于 3200 和 340 個不同的大腸桿菌基因組。 當應用于微生物群落 DNA 時， C0t1/2值 被用作遺傳多樣性的一個參數(shù)，它包含了 群落總的遺傳信息（豐富度成分）和不同遺傳型之間的差異信息（均勻度成分）。這使得兩個不同結(jié)構的群落可能具有一致的 C0t1/2值 。 圖 8 大腸桿菌的 DNA 的重新組合（ C0t，其中 C0代表摩爾核苷酸每升， t代表時間 /秒），或未處理土壤中的細菌部分（ K），厭氧條件下的土壤（ N2）和 CH4作為主要碳源的土壤（ CH）（ 216。vre229。s 等 ， 1998） 10 表 1 土壤微生物多樣性研究的分子學方法 方法 信息類型和 分辨率 在土壤微生物分析中應用 DNA 重新組合速率 總遺傳多樣性，理論性的物種數(shù)量，群落基因組 大小。低分辨率 整體分析群落的遺傳可能性，比較分析全部的生物多樣性 摩爾 %G+C 組成 群落遺傳圖譜，整個群落組成。低分辨率 比較分析群落組成的全部變化 PCRDGGE/TGGE 個別條帶測序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢群落成員的聯(lián)系。中等分辨率 比較分析群落結(jié)構，群落組成的時間和空間的變化 PCRSSCP 個別條帶測序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢群落成員的聯(lián)系，中等分辨率 比較分析群落結(jié)構，群落組成的時間和空間的變化 PCRTRFLP 群落組成，優(yōu)勢群落成員的相對數(shù)量豐度。中等分辨率 比較分析微生物種群 的分布，監(jiān)測群落組成的變化 PCRARDRA 簡單群落，種群或者系統(tǒng)發(fā)育屬的遺傳指紋圖譜。低分類學水平的測定，高分辨率 比較分析微生物種群動力學，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCRRISA 種群或者系統(tǒng)發(fā)育組的遺傳指紋圖譜，同時分析不同的微生物屬，在物種或?qū)俚乃缴蠝y定。高分辨率 比較分析微生物種群動力學，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCR of rDNA克隆和測序 系統(tǒng)發(fā)育多樣性，群落組成鑒定。高分辨率 群落成員的系統(tǒng)發(fā)育多樣性 功能基因 PCR克隆并測序 功能多樣性。高分辨率 比較 分析群落功能性的潛能 RNA 點墨雜交 群落成員的代謝活力的系統(tǒng)發(fā)育鑒定。中等分辨率 定性和定量分析群落中具有代謝活性的種群， 活的群落成員的系統(tǒng)發(fā)育信息 熒光原位雜交 代謝活性的微生物的檢測和確切的計算。中等分辨率 比較分析群落結(jié)構，檢測和鑒定活細胞，群落成員的直接系統(tǒng)發(fā)育信息 注： G+C 鳥嘌呤 +胞嘧啶， PCR 聚合鏈反應， DGGE變性梯度凝膠電泳， TGGE溫度梯度凝膠電泳， SSCP 單鏈構象多態(tài)性， TRFLP末端限制性片段電泳， ARDRA擴增核糖體 DNA限制性分析， RISA基因間隔區(qū)分析， FISH熒光原 位雜交 11 表 2 在 6 倍檸檬酸鹽、 30%二甲亞砜中計算得出的微生物群落遺傳多樣性重新組合動力學 DNA 來源 C0t1/2 土壤群落 DNA 堿基大小 （ bp） DNA 土壤 / 大腸桿菌 DNA 大腸桿菌 106 1 牧地土壤（ StendO） 6300 1010 8000 耕種土壤（ StendS） 270