微生物學(xué)第八章微生物與基因工程-文庫(kù)吧
2025-01-03 01:37 本頁(yè)面
【正文】 體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成 。 柯斯質(zhì)粒載體含有來(lái)自質(zhì)粒的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn) 、 抗藥性標(biāo)記 、 一個(gè)或多個(gè)限制酶單一位點(diǎn) ，以及來(lái)自 λ噬菌體粘性末端的 DNA片段 ， 即 cos位點(diǎn) ， 其對(duì)于將 DNA包裝成 λ噬菌體粒子是必需的 。 ? 柯斯質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： ① 具有噬菌體的高效感染力，而在進(jìn)入宿主細(xì)胞后不形成子代噬菌體僅以質(zhì)粒形式存在； ② 具有質(zhì)粒 DNA的復(fù)制方式，重組 DNA注入宿主細(xì)胞后，兩個(gè) cos位點(diǎn)連接形成環(huán)狀 DNA分子，如同質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制； ③ 具有克隆大片段外源 DNA的能力，柯斯質(zhì)粒本身一般只有5~7kb左右，而它可克隆外源 DNA片段的極度限值竟高達(dá)45kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)質(zhì)粒載體及 λ 噬菌體載體的克隆能力。 M13噬菌體載體 ?M13是大腸桿菌絲狀噬菌體 ， 其基因組為環(huán)狀 ssDNA，大小為 6 407bp。 感染雄性 （ F+或 Hfr） 大腸桿菌并進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)變成復(fù)制型 （ RF） dsDNA， 然后以滾環(huán)方式復(fù)制出 ssDNA。 每當(dāng)復(fù)制出單位長(zhǎng)度正鏈 ， 即被切出和環(huán)化 ， 并立即組裝成子代噬菌體和以出芽方式 （ 即宿主細(xì)胞不被裂解 ） 釋放至胞外 。 ? 野生型 M13不適于直接作為克隆載體，因此人們對(duì)其進(jìn)行改造，構(gòu)建了一系列 M13克隆載體。 噬菌體質(zhì)粒載體 ? 噬菌體質(zhì)粒 （ phagemid或 phasmid） 是由絲狀噬菌體和質(zhì)粒載體 DNA融合而成 ， 兼有兩者優(yōu)點(diǎn) ， 這類(lèi)載體具有來(lái)自 M13或 f1噬菌體的基因間隔區(qū) （ 內(nèi)含 M13或 f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn) ） 和來(lái)自質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn) 、 抗藥性標(biāo)記 、 一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)等 。 ?噬菌體質(zhì)粒載體在應(yīng)用上具有許多優(yōu)點(diǎn)： ① 載體本身分子小 ， 約為 3 000bp， 便于分離和操作； ② 克隆外源 DNA容量較 M13噬菌體載體大 ， 可克隆 10kb外源 DNA片段； ③ 可用于制備單鏈或雙鏈 DNA， 克隆和表達(dá)外源基因 。 真核生物的克隆載體 ?真核生物載體 ， 主要有以下幾大類(lèi)： ?（ 1） 、 酵母質(zhì)粒載體 ① 、 附加體質(zhì)粒 （ epislmal plasmid） ② 、 復(fù)制質(zhì)粒 （ replicating plasmid） ③ 、 整合質(zhì)粒 （ integrating plasmid） ?（ 2） 、 真核生物病毒載體 ① 、 哺乳動(dòng)物病毒載體 ② 、 昆蟲(chóng)病毒載體 ③ 、 植物病毒載體 人工染色體 ?酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome, YAC）是一類(lèi)目前能容納最大外源 DNA片段人工構(gòu)建的載體 。 ?酵母染色體的控制系統(tǒng)主要包括三部分： ① 著絲粒 （ centromere, CEN） ， 它的作用是使染色體的附著粒與有絲分裂的紡錘絲相連 ， 保證染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中正確分配到子代細(xì)胞； ② 端粒 （ telomere, TEL） ， 位于染色體兩個(gè)末端 ， 功能是保護(hù)染色體兩端 ， 保證染色體的正常復(fù)制 ， 防止染色體 DNA復(fù)制過(guò)程中兩端序列的丟失； ③ 酵母自主復(fù)制序列 （ autonomously replicating sequence, ARS） 其功能與酵母細(xì)胞復(fù)制有關(guān) 。 表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌 、 酵母或動(dòng) 、 植物細(xì)胞中得到高效表達(dá) ， 以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動(dòng) 、 植物的遺傳性狀 。 ?所謂表達(dá)載體 （ expression vector） 是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列 ， 能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體 。 也即克隆載體只是攜帶外源基因 ， 使其在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增；表達(dá)載體不僅可使外源基因擴(kuò)增 ， 還可使其表達(dá) 。 原核生物和真核生物的表達(dá)載體有一些共同的要求 ， 但兩者的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制有很大不同 ， 故需要分別采用原核生物和真核生物的調(diào)控原件來(lái)構(gòu)建 。 表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件 ?表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件包括： – 啟動(dòng)子、 – 核糖體的結(jié)合位點(diǎn)、 – 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) – 密碼子偏愛(ài)性 – 等。 表達(dá)載體中調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)的作用 ?通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中 。 這是由于某些有價(jià)值的外源蛋白可能對(duì)宿主細(xì)胞是有毒的 ， 外源蛋白的過(guò)量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長(zhǎng)；此外某些載體的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子 ， 如 T7啟動(dòng)子 ， 強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)非常強(qiáng)以致使正常宿主基因不能表達(dá) 。 ?基于以上事實(shí) ， 宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩個(gè)階段進(jìn)行 。 第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)直至獲得足夠量的細(xì)胞 。 第二階段是啟動(dòng)開(kāi)關(guān) ， 使所有細(xì)胞外源基因同時(shí)高效表達(dá) ， 產(chǎn)生大量有價(jià)值的表達(dá)產(chǎn)物 。 ?在原核基因表達(dá)調(diào)控中 ， 阻遏蛋白－操縱基因系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)的作用 。 當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因相結(jié)合時(shí) ， 能夠阻止基因的轉(zhuǎn)錄 。 加入誘導(dǎo)物 ， 使其與阻遏蛋白結(jié)合 ， 解除阻遏 ， 從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄 。 二、微生物與基因工程工具酶 ? 基因工程所用的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化獲得的 。 ?對(duì) DNA片段進(jìn)行操作 ， 必須要有能 “ 切
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