【正文】 鑒于復(fù)雜的食物網(wǎng)會增強(qiáng)土壤應(yīng)對外界干擾的彈力，我們應(yīng)該 采取積極的行動以保證高的微生物多樣性，盡管測定土壤中的微生物多樣性仍然很困難。但是，當(dāng)這個(gè)過程發(fā)生時(shí)，觀察到的轉(zhuǎn)化頻率是很低的。事實(shí)上，轉(zhuǎn)基因植物對于微生物群落 23 的相關(guān)影響比與季節(jié)、田地位置和年份等環(huán)境因素引起的一般變化會更加深遠(yuǎn)。從另一方面說，檢測土壤中所有的微生物活性并且將其整合列一個(gè)表以在數(shù)量上評估土壤代謝活力是很難的。 在土壤中存在某些功能的冗余和重復(fù)，因此，土壤微生物多樣性的減少一般不會改變土壤過程的速率，例如 C 和 N 的礦化。 這突出了像熱帶雨林、珊瑚礁等這種復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的弱點(diǎn)。 毫無疑問，現(xiàn)在人類和動物醫(yī)學(xué)上的問題是由于在 醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)中 毫無限制的使用抗生素 造成的，而不是由于使用攜帶抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物所造成。在評估抗生素抗性問題方面，抗生素本身的特性和抗生素抗性特點(diǎn)被認(rèn)為是重要的因素。關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物使用的抗性基因的流行，目前 很少有人提供研究的相關(guān)數(shù)據(jù)。 不能排除不同的環(huán)境生態(tài)位中發(fā)生植物和細(xì)菌之間的基因水平轉(zhuǎn)移，但是這種稀有事件的生態(tài)影響取決于其本身已具有的特性的選擇和散播。但是， Nielsen 等發(fā)現(xiàn)，棲居土壤中的沒有實(shí)力的 Aciobacter 細(xì)胞在增加營養(yǎng)后會變成有能力的細(xì)胞。然而， 不能排除 像 土壤中型動物區(qū)系 的消化管這樣的可以基因轉(zhuǎn)化 的 熱點(diǎn)的出現(xiàn)的可能性 。 通過甜菜 DNA 轉(zhuǎn)化 Aciobacter 在無菌土壤中可以檢 測到，但是在非無菌土壤中就檢測不到。但是，在剛開始種植轉(zhuǎn)基因植物時(shí)并沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。而且對于含有 10bp 被刪除的 nptII 基因的 Aciobacter 細(xì)胞來說，從各種各樣的攜帶 nptII 標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因植物 （例如馬鈴薯、煙草、甜菜、 甘藍(lán)型油菜 和番茄）中轉(zhuǎn)化 DNA 會導(dǎo)致細(xì)菌基因組整合不完整的 nptII 基因。大量的非細(xì)菌 DNA和植物 DNA 的 高甲基化速率被認(rèn)為是阻止抗性基因從轉(zhuǎn)基因植物向細(xì)菌轉(zhuǎn)移 的因素。作者指出，兩種 DNA 似乎可以增加轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)散： 成長的根部系統(tǒng)和花粉。 隨著植物的衰老和土壤中微生物對于植物殘?bào)w的降解，轉(zhuǎn)基因 DNA 也能隨著被降解。 Gebhard 和 Smalla 等在田間釋放具有轉(zhuǎn)基因 抗叢根病的甜菜然后研究其轉(zhuǎn)基因DNA 在土壤中的留存。 Nielsen等證實(shí) 熒光假單胞菌、 洋蔥伯克霍德菌 和 不動細(xì)菌屬 的細(xì)胞熔解產(chǎn)物是在無菌的和非無菌的土壤中轉(zhuǎn)化 DNA 的可用原材料，并且細(xì)胞殘骸保護(hù) DNA 以防止在土壤中失活，在這過程中細(xì)胞壁或許在細(xì)胞死后起著重要的作用。 不同的課題組研究顯示，盡管 DNA 酶普遍存在，但是不同條件下都可以檢測到高分子的自由 DNA。 Demaneche 等最近 20 發(fā)現(xiàn)可以自然轉(zhuǎn)化 的細(xì)菌數(shù)量比估計(jì)的要多。自然轉(zhuǎn)化 是指有能力的細(xì)菌可以通過敏感性的 DNA酶來獲得自由 DNA的過程。 但是，這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)與自然條件變化無關(guān)。通過 FAME方法可以分離鑒定土壤中的優(yōu)勢菌，可以提供根圍細(xì)菌群落的可培養(yǎng)優(yōu)勢菌的分類學(xué)組成。 在某些情況下，檢測到的某些樣品中的一個(gè)或者其他所有的品種的根圍群落結(jié)構(gòu)差異不是由于產(chǎn)生 T4 熔解酵素，而是極有可能與品種的成長特征不同有關(guān)。第二種方法是使用 Biolog GN 微平板分 析群落分解代謝的功能單元。此外，研究證實(shí)根部檢測到有釋放的 T4 熔解酵素，導(dǎo)致根表面有殺菌的能力。但是，鑒于轉(zhuǎn)基因變種 Quest 沒有與其 未轉(zhuǎn)基因的父本作對照，所以這種差異是否是由遺傳改造引起尚不清楚。 至今，只有一少部分研究是關(guān)于分析田間條件下轉(zhuǎn)基因植物對根圍土壤的細(xì)菌群落組成的潛在影響的。 轉(zhuǎn)基因植物對于根圍 微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能組成的影響在小規(guī)模水平的田間釋放研究比較理想 ，因?yàn)檠芯匡@示 ，溫室觀察與田間條件 存在很大的不同。但是， 評估轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致的微生物根圍群落潛在的轉(zhuǎn)移十分重要，基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)可以關(guān)聯(lián)自然浮動的潛在變化。或者說是因?yàn)閷ν寥牢⑸锶旱挠绊戨y以測定？ 轉(zhuǎn)基因植物會出現(xiàn)什么樣的影響？目前，在大規(guī)模使用轉(zhuǎn)基因植物對根圍和大部分土壤中微生物群落的影響方面，公認(rèn)的有兩種 推測 ： 、抗細(xì)菌活性或其他的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，接近根部的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能組成什么時(shí)候會發(fā)生變化？ DNA，尤其是轉(zhuǎn)基因植物中作為標(biāo)記的抗性基因。這些可以通過一系列的常規(guī)的工具和先進(jìn)的分子技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，這在其他的章節(jié)已有敘述。 微生物制劑的國際標(biāo)準(zhǔn)不同的國家都不一樣。在任何土壤變動下，轉(zhuǎn)基因標(biāo)記沒有影響任何的土壤酶活性（卡那霉素中加入乳糖）。除了能防治腐酶屬引起的枯萎病以外，它也能有效地防治馬鈴薯軟腐病病原菌 胡蘿卜軟腐歐文氏菌 亞種 和 馬鈴薯金線蟲 。隨后， De Leij 等作了研究 ，使用標(biāo)記基因 改造菌株后釋放進(jìn)田間， 調(diào)查插入基因 對各種組成成分生態(tài)競爭力 潛在的代謝壓力 。至今研究最多的轉(zhuǎn)基因微生物制 劑有根瘤菌屬、假單胞菌屬和固氮螺菌屬，這些細(xì)菌已經(jīng)被用來在田間規(guī)模做種子保護(hù)劑以測試其效果，也以此深入的研究其試用的安全相關(guān) 17 的方面，例如它們在土壤環(huán)境 中 的命運(yùn)。使用與以下系統(tǒng)發(fā)育屬的細(xì)菌相異的探針： α變形菌（ ALF1b）、 β變形菌（ GAM42a）、 δ變形菌（ SRB385）、嗜纖維素菌 屈撓桿菌 似細(xì)菌（ CF319a）、低 mole%（ G+C）的革蘭氏陽性菌和高 mole%（ G+C）的革蘭氏陽性菌。結(jié)果顯示大量的微生物多樣性檢測和群落結(jié)構(gòu)分析方法可以區(qū)別不同程度污染的土壤，可以成為壓力和干擾的有效指標(biāo)。在重度金屬污染的土壤中孤立群的數(shù)量和 α變形菌亞綱的克隆變化明顯，克隆數(shù)比例是 38%，孤立群僅只有 14%。 這個(gè)群體在低 金屬 污染的土壤中的豐富度是高 金屬 污染土壤的兩倍。 低和高金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)是用基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行雜交得出的，包括 α變形菌（ ALF1b）、 β變形菌（ GAM42a） 、 δ變形菌（ SRB385）、嗜纖維素菌 屈撓桿菌 似細(xì)菌（ CF319a）、低 mole%（ G+C）的革蘭氏陽性菌和高 mole%（ G+C）的革蘭氏陽性菌。 沒有污染的土壤群落的 DNA 復(fù)雜度是 1010bp。 PCR 聯(lián)合 DGGE 顯示，這兩種 土壤中的不同細(xì)菌類型的數(shù)量很高，這意味著這兩種土壤多樣性物種豐 度很高。這兩種土壤有相似的質(zhì)地（砂壤土），并且坐落于挪威西部 400 米遠(yuǎn)。 然后通過系統(tǒng)發(fā)育探針點(diǎn)墨印跡雜交鑒定這些克隆。 克隆 rRNA 基因分析 克隆技術(shù)可以替代指紋圖譜方法 來分析 PCR 擴(kuò)增物，并且已經(jīng)被廣泛的用來分析微生物群落。每個(gè)細(xì)胞的低生理活性往往與低核糖體含量有關(guān)，因此，低生長率或者餓死的細(xì)胞就有可能檢測不出來。 已經(jīng)證實(shí)，通過使用系統(tǒng)發(fā)育探針， 群落指紋圖譜的點(diǎn)跡和 Southern印跡雜交 在研究群落變化和鑒定大量 的優(yōu)勢群落成員時(shí)很有效。土壤微生物群落主要親緣型的相對豐度可以用群落 DNA 數(shù)量點(diǎn)墨雜交或者通過基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行 FISH（熒光原位雜交）。 這種方法在研究功能性群體方面特別有效。特殊引物也適用于檢測特殊基因，例如類芽孢桿菌，布克氏菌和桿菌。同時(shí)使用許多引物靶標(biāo)相同樣品中的不同的系統(tǒng)發(fā)生基團(tuán)可以評估一個(gè)群落中的不同微生物種型的種群動力學(xué)。即使很相近的菌株，核糖體的非編碼間隔區(qū)大小和核苷酸序列都存在變化。限制性 酶切得到的片段通過自動 DNA 測序凝膠分離。 這些分析方法已經(jīng)被用來區(qū)分群落和研究土壤中的群落結(jié)構(gòu)和動力學(xué)。然后擴(kuò)增物通過限制性酶切再進(jìn)行凝膠或者毛細(xì)管凝膠電泳分離。除了 PCR 本身存在的誤差以外，這種方法的一個(gè)不足就是某一單個(gè)細(xì)菌物種可能 產(chǎn)生許多條帶，因?yàn)樵S多操縱子的存在或者單鏈 PCR 擴(kuò)增物有很多個(gè)構(gòu)象。因此， DNA二級結(jié)構(gòu)改變了單鏈 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移速率，從而使其被分辨出來。在 SSCP 中，一個(gè)引物是在 5’端磷酸化的，并且擴(kuò)增物中磷酸化的鏈被 λ 核酸外切酶選擇性的酶切。 DGGE/TGGE 方法分析 從反轉(zhuǎn)錄 PCR 的 rRNA 分子獲得的 PCR 擴(kuò)增物或許可以得出代謝活躍的微生物種群的指紋圖譜。但是， 當(dāng)應(yīng)用于不是很復(fù)雜的群落時(shí)， 就可以 假設(shè)通過 DGGE/TGGE 獲得的可辨別的條帶代表群落中的大量的優(yōu)勢微生物種群。部分變性的或者全部變性的分子停止在凝膠中遷移， DNA 片段由于不同的堿基組成和序列而在凝膠上占據(jù)不同的位置。這種分離是基于 在一個(gè)線性變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中 PCR擴(kuò)增的 DNA分子具有不同的遷移率。基于 PCR 的群落指紋圖譜技術(shù)有許多的優(yōu)點(diǎn)， 包括：快速，可以平行分析大量的樣品；可靠，高度的可重復(fù)性；提供一個(gè)群落里的種群的性質(zhì)和數(shù)量上的信息；可以通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序列來評價(jià)群落成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。他們表明來自相似棲息環(huán)境不同地理區(qū)域的微生物有相關(guān)性，但是 具有相同官能團(tuán)的微生物可能屬于不同的系統(tǒng)發(fā)生組（親緣型），這反映了生態(tài)位的不同。 所以，土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育和功能之間的關(guān)聯(lián)信息可以通過克隆體的結(jié)合研究來隱藏 rRNA，功能性的基因則可以通過克隆和雜交 來獲得。在理論上，BAC 文庫可以 容納全部的微生物群落基因組，并且可以用來繪制基因組圖譜、篩選特殊物種、評估系統(tǒng)發(fā)育分析和功能多樣性。從土壤微生物 群落中提取的 DNA 通常很復(fù)雜，重聯(lián)率也很低，但是如果在檸檬酸鹽溶液和 30%DMSO 中測量時(shí)它將會提高。nen 等 . 1998）。中等分辨率 定性和定量分析群落中具有代謝活性的種群， 活的群落成員的系統(tǒng)發(fā)育信息 熒光原位雜交 代謝活性的微生物的檢測和確切的計(jì)算。低分類學(xué)水平的測定，高分辨率 比較分析微生物種群動力學(xué)，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCRRISA 種群或者系統(tǒng)發(fā)育組的遺傳指紋圖譜，同時(shí)分析不同的微生物屬，在物種或?qū)俚乃缴蠝y定。低分辨率 整體分析群落的遺傳可能性，比較分析全部的生物多樣性 摩爾 %G+C 組成 群落遺傳圖譜，整個(gè)群落組成。這使得兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的群落可能具有一致的 C0t1/2值 。 未受干擾的土壤 DNA 其C0t1/2 值 是 6300 摩爾每秒每升，相當(dāng)于大約 8000 個(gè)不同的大腸桿菌基因組。 用 未處理的天然土壤作為對照。重聯(lián)的 DNA 部分可以通過 C0t 值 來反映，其中 C0是指摩爾核苷酸每升， t 是指以秒計(jì)算的時(shí)間。這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在 沒有被 檢測和分析 到 片段的情況下 ，群落中的一些非優(yōu)勢微生物通過 PCR就可能檢測不出來。這種方法有一個(gè)缺陷 ,就是兩個(gè)具有相似堿基差異的群落不一定有相似的物種組成，這是因?yàn)椴煌奈锓N經(jīng)常有相似的堿基組成。即使 這種方法被認(rèn)為分辨率很低，但是它可以用來指示整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)的整個(gè)變化，尤其是多樣性很低的情況。 5 用總基因組 DNA 方法來分析生物多樣性 土壤微生物群落的組成情況可以通過檢測群落 DNA 的堿基差異 [摩爾 %鳥嘌呤 +胞嘧啶（ %G+C） ]來獲得。 TRFLP 和群落指紋印跡技術(shù) [變性 /溫度梯度凝膠電泳（ DGGE/TGGE）；單鏈結(jié)構(gòu)多態(tài)性（ SSCP） ]，這些基于分離 PCR 擴(kuò)增的 rRNA 和rDNA 分子的技術(shù)已經(jīng)被成功的用來分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)。 8 擴(kuò)增的結(jié)果或者用來限制性分析或者基于變性或構(gòu)象性質(zhì)進(jìn)行分離。 中等分辨率的 方法包括系統(tǒng)發(fā)育探針的應(yīng)用，或者是群落 DNA 或者 RNA 的空位或者點(diǎn)墨法雜交，或者是完整的細(xì)胞熒光原位雜交。 圖 7 縱覽分析微生物群落的非培養(yǎng)的分子生物方法。這些技術(shù)提供了一種更加精確的土壤微生物多樣性程度衡量方法。 4 檢測微生物多樣性的分子生物學(xué)方法 土壤微生物多樣性通常都是由像可行的培養(yǎng)方法、 CLPP 和流式細(xì)胞儀等這些方法來分析。 Yan等發(fā)現(xiàn)有機(jī) C 和功能多樣性之間存在一個(gè)斷棍的關(guān)系，并且他們也重新計(jì)算了 Sharma 等給出的數(shù)據(jù)，該作者曾經(jīng)說發(fā)現(xiàn)了H’和微生物生物量 之間存在線性關(guān)系。此外，用這種方法不能檢測出真菌對土壤功能的作用。 在土壤生態(tài)學(xué)中變得日益重要的一個(gè)有效方法就是 CLPP（群落水平生理學(xué)模型）。絕大多數(shù)方法得出的是可能 的活力 ， 而不是真實(shí)的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)是在充足的底物濃度、最優(yōu)的 pH 值、溫度值和通常在土壤泥漿里 的條件下進(jìn)行 。如果