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2024-12-30 04:37 本頁(yè)面
【正文】 表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會(huì)有質(zhì)量不高或者背景的問題。 我們建議： 長(zhǎng)期存放菌株和 pET重組子應(yīng)該在菌液中加入甘油并放置于－ 70℃ 保種。 解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標(biāo)簽的 pET載體 ，例如 pET28和 pET30序列載體。 原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（ 6） ? 有時(shí)除了全長(zhǎng)的目的蛋白以外，還能看到截短的產(chǎn)物，這時(shí)怎么回事？ ? 回答： 一個(gè)最直接原因就是蛋白水解了。 如果稀有密碼子集中出現(xiàn)在氨基端情況更為嚴(yán)重。 但也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴(yán)緊的載體 /宿主菌組合 (比如含有 plysE的宿主菌 )等，這時(shí)在誘導(dǎo)后菌落還是會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。某些情況下降低誘導(dǎo)時(shí)的培養(yǎng)溫度至 2530 ℃ ，可能提高蛋白運(yùn)輸?shù)谋壤? 原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（ 3） ? 如果目的蛋白包含信號(hào)序列，它會(huì)不會(huì)被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目的蛋白甚至可以被分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中？ ? 回答：如果目的蛋白包含 ompT或 pelB這樣的前導(dǎo)序列，理論上它應(yīng)該被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略 大致有八種策略： （ 1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免 肽鏈相互聚合； （ 2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成； （ 3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度； （ 4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替強(qiáng)啟動(dòng)子，降低重組蛋白的合 成速度； （ 5）選擇適合的宿主菌株； （ 6）表達(dá)含可溶性多肽或信號(hào)肽的重組蛋白，提高可溶性； （ 7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （ 8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的 pH值。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá)策略 ? 采用高強(qiáng)度啟動(dòng)子 如 T7啟動(dòng)子； ? 將目的基因所有密碼子都換成大腸桿菌 ? 偏好的密碼子（需要重新合成基因）， ? 或采用含有大腸桿菌稀有密碼子 tRNA ? 的 Rosetta系列菌株。 Rosetta系列是來自 BL21lacY1，所以它具有 BL21lacY1的所有特性。在這些菌株中表達(dá)蛋白， 可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。 Lac滲透酶的突變使進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的 IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達(dá)濃度可以隨著 IPTG濃度而改變。 BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達(dá)的表達(dá)菌株 。在設(shè)計(jì) PCR擴(kuò)增引物時(shí)加入與 LIC載體互補(bǔ)的序列， PCR產(chǎn)物用 3’→5’ 的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補(bǔ)的序列。 ? 3. 插入一個(gè)定位到周質(zhì)空間的信號(hào)肽序列。 ? 根據(jù)是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體。 ? Invitrogen pET100/DTOPO載體圖譜 Novagen公司 pET表達(dá)載體序列 ? Novagen公司 （ Merck的子公司）出品了多種原核表達(dá)載體系列，其中的 pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng) ，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達(dá)了各種各樣的異源蛋白。像之前 Novagen大部分載體都是用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質(zhì)粒，但是 Invitrogen的表達(dá)系統(tǒng)大量運(yùn)用了它的 TOPO技術(shù)和 Gateway技術(shù)。 強(qiáng)大的 T7啟動(dòng)子完全專一受控于 T7 RNA 聚合酶，而 高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA的速度比大腸桿菌 RNA聚合酶快 5倍 —— 當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過 T7表達(dá)系統(tǒng)， 幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白 ；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的 50%以上。同樣的， PL、 PR 表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶 cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子 ? 以 λ噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 PL、 PR 構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子 ? 現(xiàn)在的 Lac/Tac/trc載體上通常還帶有 lacIq 基因，以表達(dá)更多 lacI阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。其轉(zhuǎn)錄受 CAP正調(diào)控和 lacI負(fù)調(diào)控。 ? 可溶性表達(dá) ： 大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒 ， 包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高。 對(duì)于特別小的分子建議用較大的 Tag（如 GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小 Tag以減少對(duì)目的蛋白的影響。這種方法有助于避免菌體生長(zhǎng)前期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的幾種表達(dá)方式 ? 組成型表達(dá)： 表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，分別是 Rho因子作用下使 mRNA轉(zhuǎn)錄終止的終止子和根據(jù)模版上的對(duì)稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止 mRNA轉(zhuǎn)錄的終止子。 從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念 ? 對(duì)于做表達(dá)來說，如果不是要研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，通常比較少
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