微生物基因工程培訓(xùn)講義-免費(fèi)閱讀
【正文】 請盡量保持甘油濃度為 8％左右。 起始密碼子 AUG（ Met）的上游在RNA編碼區(qū)有類似于核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（ AAGGAGG）的間隔序列（通常是 513個(gè)核苷酸）時(shí)，容易出現(xiàn)這種問題。所有 pET載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是下列兩種之一： ? Rbs NdeI/NcoI ? 5’…AAGAAGGAGAUAUACAUAUG…3’ ? 5’…AAGAAGGAGAUAUACCAUGG…3’ ? 如果發(fā)現(xiàn)表達(dá)很差，你可以通過檢查編碼插入序列的鏈上的與上述序列互補(bǔ)的序列： ? 5‘CATATGTATATCTCCTTCTT3’或 ? 5’CCATGGTATATCTCCTTCTT3‘ ? 以確定是否因?yàn)榇嬖跐撛诘亩壗Y(jié)構(gòu)造成麻煩。除了信號肽對蛋白質(zhì)的運(yùn)輸有影響，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成熟區(qū)對蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)也有影響。 使用 pET表達(dá)系統(tǒng)的常見問題分析 幾個(gè)常見問題如下表： 原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（ 1） ? 目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)。 Rosetta? 是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計(jì)的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子 tRNA，包括 AUA， AGG， AGA， CUA， CCC和GGA。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。 ? 在重組技術(shù)上， Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式 ： LigationIndependent cloning，簡稱 LIC。 Novagen公司的 pET表達(dá)載體系列 ? pET Vectors with unique features include: ? pET31b(+) for high yield bioproduction of peptides and small proteins ? pET32ac for production of soluble, active target proteins in E. coli ? pET33b for production of target proteins suitable for sitespecific 32Plabeling ? pET39b and 40b using Dsb tags for export and periplasmic folding of target proteins ? pET41ac and 42ac with popular GST fusion tags for enhanced production and solubility ? designed for cloning and highlevel expression of polypeptide sequences fused with the 495 aa NusA (Nus?Tag?) protein ? pET44ac with Nus?Tag? sequence plus N and Cterminal His?Tag sequences ? pET45b(+) with aminoterminal His?Tag? sequence and minimal extraneous sequences ? pET46 Ek/LIC prepared vector for ligationindependent cloning, with aminoterminal His?Tag? sequence ? pET47b(+) through pET50b(+) with HRV 3C Protease cleavage site for efficient fusion tag removal ? Additional vectors in this table include: ? pLacI ? pLysE and pLysS Novagen公司的PET32a表達(dá)載體圖譜 Novagen公司的 pET表達(dá)載體選擇 ? 從開始涉及表達(dá)的時(shí)候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇，Novagen公司僅提供三個(gè)載體： pET21(+)， pET24(+)和 pET23(+)。 常用的幾種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) ? GE（原安瑪西亞） pGEX系列，特點(diǎn)：使用該系列載體可以很方便進(jìn)行下一步重組蛋白的純化。 cI基因的溫度敏感突變體 cI857(ts)常常被用于調(diào)控 PL、 PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 ? trc啟動(dòng)子 是 trp啟動(dòng)子和 lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，同樣具有比 trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受 lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略 大致有八種策略： （ 1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生 肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合（例如 Takara的 Chaperone plasmid Set）； （ 2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成； （ 3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度； （ 4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替強(qiáng)啟動(dòng)子，降低重組蛋白的合 成速度； （ 5）選擇適合的宿主菌株； （ 6）表達(dá)含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性； （ 7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （ 8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的 pH值。 另外也有啟動(dòng)子是
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1