微生物基因工程培訓(xùn)講義-文庫吧
2024-12-22 04:37 本頁面
【正文】 也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。 持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白。 因為過量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會影響細(xì)菌的生長，反過來影響表達(dá)量的積累。 ? 誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)： 表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達(dá)對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。 另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的幾種表達(dá)方式 ? 融合表達(dá) ： 表達(dá)載體的多克隆位點上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（ Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分 N端或者 C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測。 對于特別小的分子建議用較大的 Tag（如 GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小 Tag以減少對目的蛋白的影響。HisTag是最廣泛采用的 Tag。 ? 分泌表達(dá)： 在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長，或者形成包涵體，而且表達(dá)產(chǎn)物通常是可溶的活性狀態(tài)，不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的 周質(zhì)空間 。 ? 可溶性表達(dá) ： 大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒 ， 包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合 Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性 ，比如 Thio， pMAL系統(tǒng)。 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略 大致有八種策略： （ 1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生 肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合（例如 Takara的 Chaperone plasmid Set）； （ 2）共表達(dá)折疊酶，催化共價鍵形成； （ 3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度； （ 4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動子代替強(qiáng)啟動子，降低重組蛋白的合 成速度； （ 5）選擇適合的宿主菌株； （ 6）表達(dá)含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性； （ 7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （ 8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的 pH值。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? 最早應(yīng)用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的是 Lac乳糖操縱子 ，由 啟動子 Plac、操縱基因 lacO和結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受 CAP正調(diào)控和 lacI負(fù)調(diào)控。 ? lacUV5突變能夠在沒有 CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。 lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因 lacO 上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。 乳糖的類似物 IPTG可以和 lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開 lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? tac啟動子 是 trp啟動子和 lacUV5的拼接雜合啟動子，且 轉(zhuǎn)錄水平更高 ，比 lacUV5更優(yōu)越。 ? trc啟動子 是 trp啟動子和 lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比 trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受 lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動子特性。 在常規(guī)的大腸桿菌中， lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的 lac操縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)， 能過量表達(dá) lacI阻遏蛋白的 lacIq突變菌株常被選為 Lac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株 。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? 現(xiàn)在的 Lac/Tac/trc載體上通常還帶有 lacIq 基因，以表達(dá)更多 lacI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是 IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替 IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用 lacI的溫度敏感突變體， 30度下抑制轉(zhuǎn)錄， 42度開啟轉(zhuǎn)錄。 熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且 熱誘導(dǎo)本身會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? 以 λ噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動子 PL、 PR 構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個強(qiáng)啟動子受控于 λ噬菌體 cI基因產(chǎn)物。 cI基因的溫度敏感突變體 cI857(ts)常常被用于調(diào)控 PL、 PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄， 42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的， PL、 PR 表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶 cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。 另外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控 PL、 PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的 PL表達(dá)系統(tǒng)，就是將受 trp啟動子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的 cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制 trp啟動子，抑制 cI基因的表達(dá)，從而解除強(qiáng)大的 PL啟動子的抑制。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中
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