【正文】 插入一個(gè)定位到周質(zhì)空間的信號肽序列。在這些菌株中表達(dá)蛋白， 可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。 原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（ 3） ? 如果目的蛋白包含信號序列，它會不會被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目的蛋白甚至可以被分泌到生長培養(yǎng)基中？ ? 回答：如果目的蛋白包含 ompT或 pelB這樣的前導(dǎo)序列，理論上它應(yīng)該被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。 原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（ 6） ? 有時(shí)除了全長的目的蛋白以外，還能看到截短的產(chǎn)物，這時(shí)怎么回事？ ? 回答： 一個(gè)最直接原因就是蛋白水解了。表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會有質(zhì)量不高或者背景的問題。 如果稀有密碼子集中出現(xiàn)在氨基端情況更為嚴(yán)重。 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略 大致有八種策略： （ 1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免 肽鏈相互聚合； （ 2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成； （ 3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度； （ 4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替強(qiáng)啟動(dòng)子，降低重組蛋白的合 成速度； （ 5）選擇適合的宿主菌株； （ 6）表達(dá)含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性； （ 7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （ 8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的 pH值。 Lac滲透酶的突變使進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的 IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達(dá)濃度可以隨著 IPTG濃度而改變。 ? 根據(jù)是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體。同樣的， PL、 PR 表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶 cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。其轉(zhuǎn)錄受 CAP正調(diào)控和 lacI負(fù)調(diào)控。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的幾種表達(dá)方式 ? 組成型表達(dá)： 表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。 篩選標(biāo)記和報(bào)告基因： 氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記 ，卡那霉素或者是新霉素次之，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) ? 自 20 世紀(jì) 70 年代以來 , 大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。 ? 表達(dá)載體 ：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括 啟動(dòng)子 ，多克隆位點(diǎn) ， 終止密碼 ， 融合 Tag（如果有的話），復(fù)制子， 篩選標(biāo)記 /報(bào)告基因 等。 lac和 Tac， PL和 PR， T7是最常用的啟動(dòng)子。HisTag是最廣泛采用的 Tag。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是 IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替 IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。 ? Invitrogen公司總共有四個(gè)原核表達(dá)系統(tǒng) 它們分別是：Champion? pET Expression System 、 HisPatch ThioFusion System、 pBAD Inducible Bacterial System、 pL System和T7based Systems。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入 LIC載體上。 ? 5. 硒蛋氨酸標(biāo)記 ? B834是來源于 BL21的蛋氨酸（ met）營養(yǎng)缺陷型菌株。 原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（ 4） ? IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞停止了生長，是不是表示細(xì)胞死了？ ? 回答： T7RNA聚合酶非?；钴S， T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號極強(qiáng)，因此，一旦誘導(dǎo)， 細(xì)胞的主要生理活動(dòng)都向著目的蛋白表達(dá)的方面轉(zhuǎn)化 。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時(shí)將截短蛋白與全長蛋白區(qū)分開。 重組質(zhì)粒和菌株的保存建議 ? 在實(shí)驗(yàn)室里保存重組菌株的時(shí)候，為了挑菌和傳代方便，我們常用 LB平板保存在 4℃ 冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達(dá)接種的時(shí)候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達(dá)水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。菌落形成試驗(yàn)可以用來檢測表達(dá)系統(tǒng)的性能。 原核表達(dá)需要考慮的問題 ? 在原核蛋白表達(dá)過程中，選擇構(gòu)建一個(gè)合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮 3大因素： 表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件 ,以獲得最滿意的表達(dá)效果。因此在純化時(shí)可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。 ? Champion? pET Expression System 之所以取了個(gè)冠軍系統(tǒng)的稱號是因?yàn)樗Y(jié)合了經(jīng)典的 T7表達(dá)系統(tǒng)和 Invitrogen的王牌定向 TOPO技術(shù) 及 Gateway技術(shù)，這可謂是強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手。 熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且 熱誘導(dǎo)本身會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的 周質(zhì)空間 。放在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)實(shí)驗(yàn)室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景 ？ MCS是否還是原來那個(gè) MCS？是我們要特別注意的。 四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略 原核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括： 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 、 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 、鏈霉菌表