微生物基因工程培訓講義(參考版)
2025-01-03 04:37本頁面
【正文】 特別是在大量抽提過程中。（ 15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液 1:1就行） 重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達菌株（帶 DE3的大腸桿菌）中，請盡量使用帶有 recA endA突變的克隆菌株（比如 C600， DH5a）進行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。但是要注意高濃度甘油 ( 10%)會導致質(zhì)粒不穩(wěn)定。 重組質(zhì)粒和菌株的保存建議 ? 在實驗室里保存重組菌株的時候，為了挑菌和傳代方便，我們常用 LB平板保存在 4℃ 冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達接種的時候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區(qū)分開。截短蛋白在純化全長蛋白的操作時往往造成麻煩。然而第二點翻譯起始也非常有可能。 可以通過測序發(fā)現(xiàn)此類問題，也可以用體外翻譯的方法確認重組子的表達能力。 應該注意，根據(jù)現(xiàn)有對大腸桿菌高表達的基因研究發(fā)現(xiàn)的有限的稀有密碼子，已經(jīng)觀察到由于其對應的 tRNAs水平很低，直接導致了翻譯延伸的困難。 原核表達常見的幾個問題及回答（ 5） ? （ 2）目的基因中稀有密碼子比較多也是常見的表達水平低的原因。 原核表達常見的幾個問題及回答（ 5） ? 除了毒性和降解，還有些什么因素會影響目的蛋白的表達水平？ ? 回答： ? （ 1） mRNA轉(zhuǎn)錄子中的二級結(jié)構(gòu)會干擾 AUG翻譯起始密碼子和 /或核糖體結(jié)合位點。菌落形成試驗可以用來檢測表達系統(tǒng)的性能。 原核表達常見的幾個問題及回答（ 4） ? IPTG誘導后細胞停止了生長，是不是表示細胞死了？ ? 回答： T7RNA聚合酶非?；钴S， T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號極強，因此，一旦誘導， 細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的方面轉(zhuǎn)化 。因此在細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)及其它區(qū)域發(fā)現(xiàn)目的蛋白都很正常。如果在生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)目的蛋白的話，多半是因為細胞壁受到破壞，而并不代表蛋白是被分泌到培養(yǎng)基中的。我們建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導序列才能適合特定的應用要求。 原核表達常見的幾個問題及回答（ 2） ? 必須去除融合多肽或蛋白質(zhì)標簽才能使目的蛋白獲得活性嗎？ ? 回答：大多數(shù)情況下目的蛋白帶有 His Tag,STag,11個氨基酸的 T7Tag或 HSVTag等小肽時仍能表現(xiàn)出完全的活性。 ? 解決辦法：采用以下八種策略提高目的蛋白的可溶性。 ? 采用豐富培養(yǎng)基（如 TB）代替普通的 LB培養(yǎng) ? 基； ? 優(yōu)化大腸桿菌的生長條件和目的基因的誘導表 ? 達條件。 原核表達需要考慮的問題 ? 在原核蛋白表達過程中，選擇構(gòu)建一個合適原核表達體系需要綜合考慮 3大因素： 表達載體、宿主菌株、表達誘導條件 ,以獲得最滿意的表達效果。 ? 5. 硒蛋氨酸標記 ? B834是來源于 BL21的蛋氨酸（ met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。 ? 4. 稀有密碼子的補給 ? 不同物種有不同的密碼子偏愛性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密碼子，特別當這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時候，就會造成蛋白表達量極低，或者翻譯提前終止。 Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇 ? 3. 二硫鍵形成與溶解性增強 ? 二硫鍵的形成對某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而 Novagen也專門設(shè)計了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（ gor）和 /或硫氧還蛋白還原酶（ trxB）缺陷型的，包括 AD494， BL21trxB， Origami， Origami B和 Rosettagami? 。 通過對 IPTG濃度的控制可以使細胞微量表達或者大量表達。 ? 2. 保證所有細胞以同樣量進行表達 ? Tuner? 株及它的衍生株（ Origami? B 和 Rosetta? ）是 BL21菌株的 lacY1缺失突變型， 在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細胞中表達。 另外它的衍生株 BLR(DE3)是 recA－， RecA是大腸桿菌中介導同源重組的重要蛋白之一。因此在純化時可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入 LIC載體上。采用 LIC方法的 pET載體是線性化的，在末端有 1215個突出的堿基以在退火時和目的片斷互補。 ? 以上載體都是采用抗生素抗性篩選，如果你希望用藍白斑篩選可以使用 pETBlue系列載體。 ? 2. 轉(zhuǎn)入一個酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白， DsbA， DsbC。一般說來在大腸桿菌中不加標記外源蛋白都會以不溶的包涵體形式表達。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。 pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行表達的載體。 ? Champion? pET Expression System 之所以取了個冠軍系統(tǒng)的稱號是因為它結(jié)合了經(jīng)典的 T7表達系統(tǒng)和 Invitrogen的王牌定向 TOPO技術(shù) 及 Gateway技術(shù)，這可謂是強強聯(lián)手。 ? Invitrogen公司總共有四個原核表達系統(tǒng) 它們分別是：Champion? pET Expression System 、 HisPatch ThioFusion System、 pBAD Inducible Bacterial System、 pL System和T7based Systems。 GE（原安瑪西亞） pGEX系列 Invitrogen Champion? p
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