微生物基因工程培訓(xùn)講義-閱讀頁(yè)
2025-01-11 04:37本頁(yè)面
【正文】 oning，簡(jiǎn)稱(chēng) LIC。在設(shè)計(jì) PCR擴(kuò)增引物時(shí)加入與 LIC載體互補(bǔ)的序列， PCR產(chǎn)物用 3’→5’ 的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補(bǔ)的序列。 Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇 ? Novagen提供多種表達(dá)使用的菌株，為了提高表達(dá)量做出了各種改造，它們大致分為以下幾個(gè)種類(lèi)： ? 1. 蛋白酶缺陷型 ? 所有 B菌株的衍生株都是 lon蛋白酶和 ompT蛋白酶缺陷型的 ，這包括有 B834, BL21, BLR,Origami? B, Rosetta? 和 Tuner? 。 BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達(dá)的表達(dá)菌株 。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。 Lac滲透酶的突變使進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的 IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達(dá)濃度可以隨著 IPTG濃度而改變。 一般說(shuō)來(lái)，低濃度表達(dá)有利于蛋白的可溶性和活性。在這些菌株中表達(dá)蛋白， 可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。 Rosetta? 是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計(jì)的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子 tRNA，包括 AUA， AGG， AGA， CUA， CCC和GGA。 Rosetta系列是來(lái)自 BL21lacY1，所以它具有 BL21lacY1的所有特性。它在高度特異活性35Smet標(biāo)記和晶體成像蛋氨酸標(biāo)記中非常有用。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá)策略 ? 采用高強(qiáng)度啟動(dòng)子 如 T7啟動(dòng)子； ? 將目的基因所有密碼子都換成大腸桿菌 ? 偏好的密碼子（需要重新合成基因）， ? 或采用含有大腸桿菌稀有密碼子 tRNA ? 的 Rosetta系列菌株。 使用 pET表達(dá)系統(tǒng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析 幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題如下表： 原核表達(dá)常見(jiàn)的幾個(gè)問(wèn)題及回答（ 1） ? 目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)。 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略 大致有八種策略： （ 1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免 肽鏈相互聚合； （ 2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成； （ 3）通過(guò)降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來(lái)降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度； （ 4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替強(qiáng)啟動(dòng)子，降低重組蛋白的合 成速度； （ 5）選擇適合的宿主菌株； （ 6）表達(dá)含可溶性多肽或信號(hào)肽的重組蛋白，提高可溶性； （ 7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （ 8）誘導(dǎo)過(guò)程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的 pH值。這些肽段都較為親水，理論上都不會(huì)干擾蛋白的三維結(jié)構(gòu)。 原核表達(dá)常見(jiàn)的幾個(gè)問(wèn)題及回答（ 3） ? 如果目的蛋白包含信號(hào)序列，它會(huì)不會(huì)被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目的蛋白甚至可以被分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中？ ? 回答：如果目的蛋白包含 ompT或 pelB這樣的前導(dǎo)序列，理論上它應(yīng)該被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。除了信號(hào)肽對(duì)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸有影響，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成熟區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)也有影響。某些情況下降低誘導(dǎo)時(shí)的培養(yǎng)溫度至 2530 ℃ ，可能提高蛋白運(yùn)輸?shù)谋壤Ｔ谕ǔＧ闆r下，細(xì)胞將停止生長(zhǎng)，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。 但也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴(yán)緊的載體 /宿主菌組合 (比如含有 plysE的宿主菌 )等，這時(shí)在誘導(dǎo)后菌落還是會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。所有 pET載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是下列兩種之一： ? Rbs NdeI/NcoI ? 5’…AAGAAGGAGAUAUACAUAUG…3’ ? 5’…AAGAAGGAGAUAUACCAUGG…3’ ? 如果發(fā)現(xiàn)表達(dá)很差，你可以通過(guò)檢查編碼插入序列的鏈上的與上述序列互補(bǔ)的序列： ? 5‘CATATGTATATCTCCTTCTT3’或 ? 5’CCATGGTATATCTCCTTCTT3‘ ? 以確定是否因?yàn)榇嬖跐撛诘亩?jí)結(jié)構(gòu)造成麻煩。 如果稀有密碼子集中出現(xiàn)在氨基端情況更為嚴(yán)重。 ? （ 3） 序列中的意外的終止密碼子可能造成突變，這在 PCR克隆產(chǎn)物的情況下較為突出。 原核表達(dá)常見(jiàn)的幾個(gè)問(wèn)題及回答（ 6） ? 有時(shí)除了全長(zhǎng)的目的蛋白以外，還能看到截短的產(chǎn)物，這時(shí)怎么回事？ ? 回答： 一個(gè)最直接原因就是蛋白水解了。 起始密碼子 AUG（ Met）的上游在RNA編碼區(qū)有類(lèi)似于核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（ AAGGAGG）的間隔序列（通常是 513個(gè)核苷酸）時(shí)，容易出現(xiàn)這種問(wèn)題。 解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標(biāo)簽的 pET載體 ，例如 pET28和 pET30序列載體。另外 pET29和 pET30系列載體在 N端融合有 STag，而 C端有HisTag，因此可以先后用固定化 S蛋白和 His Binding樹(shù)脂親和純化以獲取全長(zhǎng)蛋白。 我們建議： 長(zhǎng)期存放菌株和 pET重組子應(yīng)該在菌液中加入甘油并放置于－ 70℃ 保種。請(qǐng)盡量保持甘油濃度為 8％左右。表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會(huì)有質(zhì)量不高或者背景的問(wèn)題。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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