微生物基因工程培訓講義(文件)
【正文】 譯信號極強，因此，一旦誘導， 細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的方面轉(zhuǎn)化 。 原核表達常見的幾個問題及回答（ 5） ? 除了毒性和降解，還有些什么因素會影響目的蛋白的表達水平？ ? 回答： ? （ 1） mRNA轉(zhuǎn)錄子中的二級結(jié)構(gòu)會干擾 AUG翻譯起始密碼子和 /或核糖體結(jié)合位點。 應該注意，根據(jù)現(xiàn)有對大腸桿菌高表達的基因研究發(fā)現(xiàn)的有限的稀有密碼子，已經(jīng)觀察到由于其對應的 tRNAs水平很低，直接導致了翻譯延伸的困難。然而第二點翻譯起始也非常有可能。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區(qū)分開。但是要注意高濃度甘油 ( 10%)會導致質(zhì)粒不穩(wěn)定。特別是在大量抽提過程中。（ 15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液 1:1就行） 重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達菌株（帶 DE3的大腸桿菌）中，請盡量使用帶有 recA endA突變的克隆菌株（比如 C600， DH5a）進行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。 重組質(zhì)粒和菌株的保存建議 ? 在實驗室里保存重組菌株的時候，為了挑菌和傳代方便，我們常用 LB平板保存在 4℃ 冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達接種的時候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。截短蛋白在純化全長蛋白的操作時往往造成麻煩。 可以通過測序發(fā)現(xiàn)此類問題，也可以用體外翻譯的方法確認重組子的表達能力。 原核表達常見的幾個問題及回答（ 5） ? （ 2）目的基因中稀有密碼子比較多也是常見的表達水平低的原因。菌落形成試驗可以用來檢測表達系統(tǒng)的性能。因此在細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)及其它區(qū)域發(fā)現(xiàn)目的蛋白都很正常。我們建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導序列才能適合特定的應用要求。 ? 解決辦法：采用以下八種策略提高目的蛋白的可溶性。 原核表達需要考慮的問題 ? 在原核蛋白表達過程中，選擇構(gòu)建一個合適原核表達體系需要綜合考慮 3大因素： 表達載體、宿主菌株、表達誘導條件 ,以獲得最滿意的表達效果。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。 Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇 ? 3. 二硫鍵形成與溶解性增強 ? 二硫鍵的形成對某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而 Novagen也專門設計了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（ gor）和 /或硫氧還蛋白還原酶（ trxB）缺陷型的，包括 AD494， BL21trxB， Origami， Origami B和 Rosettagami? 。 ? 2. 保證所有細胞以同樣量進行表達 ? Tuner? 株及它的衍生株（ Origami? B 和 Rosetta? ）是 BL21菌株的 lacY1缺失突變型， 在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細胞中表達。因此在純化時可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。采用 LIC方法的 pET載體是線性化的，在末端有 1215個突出的堿基以在退火時和目的片斷互補。 ? 2. 轉(zhuǎn)入一個酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白， DsbA， DsbC。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。 ? Champion? pET Expression System 之所以取了個冠軍系統(tǒng)的稱號是因為它結(jié)合了經(jīng)典的 T7表達系統(tǒng)和 Invitrogen的王牌定向 TOPO技術(shù) 及 Gateway技術(shù)，這可謂是強強聯(lián)手。 GE（原安瑪西亞） pGEX系列 Invitrogen Champion? pET Expression System等四個系列 ? 比起其它公司的原核表達系列來說 Invitrogen有個非常突出的地方就是它的重組克隆技術(shù)。 大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? T7啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流 ， 這個功能強大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的 pET系統(tǒng)為杰出代表。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄， 42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。 熱誘導不用添加外來的誘導物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導效果，而且 熱誘導本身會導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。 在常規(guī)的大腸桿菌中， lacI阻遏蛋白表達量不高，僅能滿足細胞自身的 lac操縱子，無法應付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導致非誘導條件下較高的本底表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調(diào)控產(chǎn)物表達， 能過量表達 lacI阻遏蛋白的 lacIq突變菌株常被選為 Lac/Tac/trc表達系統(tǒng)的表達菌株 。 乳糖的類似物 IPTG可以和 lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開 lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。 大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? 最早應用于大腸桿菌表達系統(tǒng)的是 Lac乳糖操縱子 ，由 啟動子 Plac、操縱基因 lacO和結(jié)構(gòu)基因組成。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的 周質(zhì)空間 。 大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式 ? 融合表達 ： 表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（ Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分 N端或者 C端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。 ? 誘導調(diào)控型表達： 表達載體采用誘導型啟動子，只有在誘導劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。端互補的 SD序列對形成翻譯起始復合物是必需的 ，多數(shù)載體啟動子下游都有 SD序列，也有些載體沒有，適合自帶 SD序列的基因表達，要留意。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。
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