微生物基因工程培訓講義(編輯修改稿)
2025-01-19 04:37 本頁面
【文章內容簡介】 幾個常用的啟動子 ? T7啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流 ， 這個功能強大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的 pET系統(tǒng)為杰出代表。 強大的 T7啟動子完全專一受控于 T7 RNA 聚合酶，而 高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA的速度比大腸桿菌 RNA聚合酶快 5倍 —— 當二者同時存在時，宿主本身基因的轉錄競爭不過 T7表達系統(tǒng)， 幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白 ；誘導表達后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?50%以上。由于大腸桿菌本身不含 T7 RNA 聚合酶，需要將外源的 T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而 T7 RNA 聚合酶的調控模式就決定了T7系統(tǒng)的調控模式 —— 非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導條件控制 T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。 常用的幾種大腸桿菌表達系統(tǒng) ? GE（原安瑪西亞） pGEX系列，特點：使用該系列載體可以很方便進行下一步重組蛋白的純化。 GE（原安瑪西亞） pGEX系列 Invitrogen Champion? pET Expression System等四個系列 ? 比起其它公司的原核表達系列來說 Invitrogen有個非常突出的地方就是它的重組克隆技術。像之前 Novagen大部分載體都是用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質粒，但是 Invitrogen的表達系統(tǒng)大量運用了它的 TOPO技術和 Gateway技術。 ? Invitrogen公司總共有四個原核表達系統(tǒng) 它們分別是：Champion? pET Expression System 、 HisPatch ThioFusion System、 pBAD Inducible Bacterial System、 pL System和T7based Systems。這四個系列的載體可謂把原核表達的發(fā)展史中出現(xiàn)過的幾種啟動子都囊括進去了，包括 T pL、pBAD和 trc啟動子，同時幾種經(jīng)典的調控方式也都出現(xiàn)了，包括有乳糖操縱子、色氨酸操縱子和阿拉伯糖操縱子。 ? Champion? pET Expression System 之所以取了個冠軍系統(tǒng)的稱號是因為它結合了經(jīng)典的 T7表達系統(tǒng)和 Invitrogen的王牌定向 TOPO技術 及 Gateway技術，這可謂是強強聯(lián)手。 ? Invitrogen pET100/DTOPO載體圖譜 Novagen公司 pET表達載體序列 ? Novagen公司 （ Merck的子公司）出品了多種原核表達載體系列，其中的 pET系列載體是目前應用最為廣泛的原核表達系統(tǒng) ，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達了各種各樣的異源蛋白。 pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉錄系統(tǒng)進行表達的載體。 Novagen公司的 pET表達載體系列 ? pET Vectors with unique features include: ? pET31b(+) for high yield bioproduction of peptides and small proteins ? pET32ac for production of soluble, active target proteins in E. coli ? pET33b for production of target proteins suitable for sitespecific 32Plabeling ? pET39b and 40b using Dsb tags for export and periplasmic folding of target proteins ? pET41ac and 42ac with popular GST fusion tags for enhanced production and solubility ? designed for cloning and highlevel expression of polypeptide sequences fused with the 495 aa NusA (Nus?Tag?) protein ? pET44ac with Nus?Tag? sequence plus N and Cterminal His?Tag sequences ? pET45b(+) with aminoterminal His?Tag? sequence and minimal extraneous sequences ? pET46 Ek/LIC prepared vector for ligationindependent cloning, with aminoterminal His?Tag? sequence ? pET47b(+) through pET50b(+) with HRV 3C Protease cleavage site for efficient fusion tag removal ? Additional vectors in this table include: ? pLacI ? pLysE and pLysS Novagen公司的PET32a表達載體圖譜 Novagen公司的 pET表達載體選擇 ? 從開始涉及表達的時候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼
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