微生物學(xué)第八章微生物與基因工程(已修改)
2025-01-30 01:37 本頁(yè)面
【正文】 第八章 微生物與基因工程 第一節(jié) 微生物與基因工程的關(guān)系 第二節(jié) 基因工程的基本過(guò)程 ? 基因工程是指對(duì)遺傳信息的分子操作和施工 。 即把分離的或合成的基因經(jīng)過(guò)改造 ，插入載體中 ， 導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi) ， 使其擴(kuò)增和表達(dá) ， 從而獲得大量的基因產(chǎn)物或者令生物表現(xiàn)出新的性狀 。 其核心是構(gòu)建重組體 DNA技術(shù) 。 簡(jiǎn)單地說(shuō)基因工程就是運(yùn)用重組 DNA技術(shù)改造生物的性狀 。 ?基因工程是一種 DNA 的體外重組技術(shù)，是根據(jù)人們的需要，在分子水平上用人工方法取得供體 DNA上的基因，在體外重組于載體DNA上，再移入原體細(xì)胞，使轉(zhuǎn)錄翻譯及復(fù)制，表達(dá)出供體基因原有的生物學(xué)特性。 ?這種使 DNA分子進(jìn)行重組，再在受體細(xì)胞內(nèi)無(wú)性繁殖的技術(shù)也被稱為分子無(wú)性繁殖或分子克隆、 重組 DNA技術(shù) 。 ? 通過(guò)基因工程改造后的菌株被稱為“ 工程菌 ” 。 基因工程是一門嶄新的生物技術(shù)。它的出現(xiàn)標(biāo)志著人類已經(jīng)能夠按照自己意愿進(jìn)行各種基因操作，大規(guī)模生產(chǎn)基因產(chǎn)物，并可設(shè)計(jì)和創(chuàng)建新的蛋白質(zhì)和新的生物物種。 DNA的特異切割、 DNA分子克隆、 DNA快速測(cè)序這三項(xiàng)技術(shù)的建立為基因工程奠定了基礎(chǔ)。 第一節(jié) 微生物與基因工程的關(guān)系 ? 微生物與基因工程的關(guān)系密切，基因工程的產(chǎn)物和發(fā)展依賴于微生物學(xué)的理論和技術(shù)。微生物在基因工程中的興起和發(fā)展過(guò)程中起著不可替代的作用?？梢哉f(shuō)一切基因工程操作都離不開微生物。 ① 基因工程所用載體不是微生物就是微生物的質(zhì)粒。 ②基因工程所用的千余種工具酶絕大多數(shù)是從微生物中分離純化得到的。 ③微生物細(xì)胞是基因工程中基因克隆的宿主，即使是植物基因工程和動(dòng)物基因工程也要先構(gòu)建穿梭載體，使外源基因或重組體 DNA在大腸桿菌中得到克隆并進(jìn)行拼接和改造，才能再轉(zhuǎn)移到植物或動(dòng)物細(xì)胞中。 微生物和微生物學(xué)在基因工程中的重要性 ④ 為了大規(guī)模表達(dá)各種基因產(chǎn)物，從事商業(yè)化生產(chǎn)，通常都是將外源基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌或者是酵母菌中以構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。 ⑤微生物的多樣性，尤其是抗高溫、高鹽、高堿、低溫等基因，為基因工程提供了極其豐富而獨(dú)特的基因資源。 ⑥有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和表達(dá)調(diào)控的理論主要是從微生物的研究中取得的，或者是將動(dòng)物、植物基因轉(zhuǎn)移到微生物中后研究而獲得的。 一、 微生物與克隆載體 ? 克隆載體 （ cloning vector） ：外源 DNA片段進(jìn)行克隆 ， 需要一個(gè)合適的載體將其運(yùn)送到細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增 。 這種以擴(kuò)增外源基因?yàn)槟康牡妮d體稱為克隆載體 。 ?把一個(gè)有用的目的 DNA片段通過(guò)重組 DNA技術(shù) ， 送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體 （ vector） 。 作為克隆載體的條件是： ? ① 載體在細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制 ， 因此載體應(yīng)是一個(gè)復(fù)制子； ? ② 載體必須具有若干個(gè)限制酶的單一切割位點(diǎn) ， 便于外源基因的插入 。 并且這些酶切位點(diǎn)應(yīng)位于載體復(fù)制的非必要去 ， 故插入適當(dāng)大小外源 DNA片段后載體仍能進(jìn)行正常的復(fù)制 。 ? ③ 載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記 。 如抗生素的抗性基因等 。 ?基因工程中使用的載體基本上均來(lái)自微生物 ， 主要包括 6大類： ?質(zhì)粒載體； ?λ噬菌體載體； ?柯斯質(zhì)粒載體； ?M13噬菌體載體； ?真核細(xì)胞的克隆載體； ?人工染色體等 。 載體的選擇 ?1）是一個(gè)有自我復(fù)制能力的復(fù)制子（ replicon) ?2) 能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率。 ?3） 載體上最好只有一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體 DNA的一定位置上。 ?4） 載體上必須有一種選擇遺傳標(biāo)記，以便及時(shí)將“工程菌”選擇出來(lái)。 質(zhì)粒克隆載體 ?（ 1） 、 質(zhì)粒載體 ?質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子 ， 經(jīng)人工修飾改造后作為克隆載體具有十分有利的特性：① 具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)； ② 具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量 ， 一般不超過(guò) 15kb； ③ 具有較高拷貝數(shù) ， 使外源 DNA得以大量擴(kuò)增； ④ 易于導(dǎo)入細(xì)胞； ⑤ 具有便于選擇的標(biāo)記和具有安全性 。 ? 噬菌體克隆載體 ?λ噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價(jià)值的克隆載體 ，具有很多優(yōu)點(diǎn)： ① 其分子遺傳學(xué)背景十分清楚； ② 載體容量較大 ， 一般質(zhì)粒載體只能容納 10多個(gè) kb， 而 λ噬菌體載體卻能容納大約 23kb的外源 DNA片段； ③ 具有較高的感染效率 ， 其感染宿主細(xì)胞的效率幾乎可達(dá) 100%， 而質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)化率卻只有 %。 ?但野生型 λ噬菌體 DNA的分子很大 ， 基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜 ， 限制酶有很多切點(diǎn) ， 且這些切點(diǎn)多數(shù)位于必需基因之中 ， 因而不適于作為克隆載體 ， 必需經(jīng)一系列改造才能用作克隆載體 。 ?構(gòu)建 λ 噬菌體載體克隆載體的基本原則是： ① 刪除基因組中非必需區(qū) ， 使基因組變小 ， 有利于克隆較大的 DNA片段； ② 除去多余的限制位點(diǎn) 。 柯斯質(zhì)粒載體 ? 柯斯質(zhì)粒載體 （ cosmid vector） 即粘粒載體 ， 是由 λ噬菌
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