【正文】 第八章 微生物的遺傳變異與育種 理想的工業(yè)發(fā)酵菌種應(yīng)符合以下要求： ① 遺傳性狀穩(wěn)定； ②生長速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染； ③目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率； ④目標(biāo)產(chǎn)物最好能分泌到細(xì)胞外，以降低產(chǎn)物抑制并利于分離； ⑤盡可能減少產(chǎn)物類似物的產(chǎn)量，以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量并利于分離； ⑥培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、來源廣、價(jià)格低廉； ⑦對(duì)溫度、 pH、離子強(qiáng)度、剪切力等環(huán)境因素不敏感； ⑧對(duì)溶氧的要求低，便于培養(yǎng)及降低能耗。 微生物的獨(dú)特生物學(xué)特性： （ 1） 個(gè)體的體制極其簡(jiǎn)單； （ 2） 營養(yǎng)體一般都是單倍體； （ 3） 易于在成分簡(jiǎn)單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖； （ 4） 繁殖速度快； （ 5） 易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物； （ 6） 菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性； （ 7） 環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)個(gè)體作用的直接性和均一性； （ 8） 易于形成營養(yǎng)缺陷型； （ 9） 各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒； （ 10） 存在多種處于進(jìn)化過程中的原始有性生殖方式； 微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多主要的生物學(xué)基本理論問題中最熱衷的 研究對(duì)象 。 對(duì)微生物遺傳規(guī)律的深入研究 ， 不僅促進(jìn)了 現(xiàn)代分子生物學(xué) 和 生物工程學(xué) 的發(fā)展 ， 而且為 育種工作 提供了豐富的理論基礎(chǔ) ， 促使育種工作從不自覺到自覺 、 從低效到高效 、 從隨機(jī)到定向 、從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展 。 研究微生物遺傳學(xué)的意義 遺傳與變異的概念 遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一 。 遺傳 (heredity)： 親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實(shí)現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息 。 特點(diǎn)：具穩(wěn)定性 。 遺傳型 （ genotype） ：又稱基因型 ， 指某一生物個(gè)體所含有的全部基因的總和； 是一種內(nèi)在可能性或潛力 。 遺傳型 + 環(huán)境條件 表型 表型 （ phenotype） ： 指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和 。是一種 現(xiàn)實(shí)存在 ， 是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀 。 代謝 發(fā)育 變異 (variation):生物體在外因 或內(nèi)因的作用下 ， 遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變 。 變異的特點(diǎn)： 極低的幾率出現(xiàn) ， （ 一般為 106～ 1010） ； 的幅度大； c. 變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的 ， 可遺傳的 。 飾變 （ modification） ： 指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄 、 轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化 。 特點(diǎn)是： 整個(gè)群體中的每一個(gè)個(gè)體都發(fā)生同樣的變化； 化的幅度?。? ， 故飾變是不遺傳的 。引起飾變的因素消失后 ， 表型即可恢復(fù) 。 例如：粘質(zhì)沙雷氏菌： 在 25℃ 下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在 37℃ 下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；如果重新將溫度降到 25℃ ，又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力。 遺傳與變異的概念 第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 種質(zhì)連續(xù)理論 ： 1883~1889年間 Weissmann提出 。 認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物 。 基因?qū)W說 ： 1933年摩爾根 （ Thomas Hunt Man） 發(fā)現(xiàn)了染色體 ， 并證明基因在染色體上呈直線排列 ， 提出了基因?qū)W說 ， 使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上 。 但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成 。 20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合 ， 可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達(dá)到一個(gè)天文數(shù)字 ， 而核酸的組成卻簡(jiǎn)單得多 ， 一般僅由 4種不同的核苷酸組成 ， 它們通過排列核組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸 ， 因此當(dāng)時(shí)認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因 ， 起活性成分是蛋白質(zhì) 。 DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明 ： 1944年以后 ， 先后有利用微生物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行的三個(gè)著名實(shí)驗(yàn)的論證 （ 肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 、 噬菌體感染試驗(yàn) 、 病毒的拆開與重建試驗(yàn) ） ， 才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì) 。 1928年， Griffith進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn)： （ 1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 對(duì)小鼠注射活 RII菌或死 SIII菌 ————小鼠存活 對(duì)小鼠注射活 SIII菌 ————————小鼠死亡 對(duì)小鼠注射活 RII菌和熱死 SIII菌 ———小鼠死亡 抽取心血 分離 活的 SIII菌 一 、 證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn) （ 一 ） 經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) （ transformation） ： ， 研究對(duì)象： Streptococcus pneumoniae（ 肺炎雙球菌 ） SIII型菌株：有莢膜 ， 菌落表面光滑 ， 有致病性 RII型菌株：無莢膜 ， 菌落表面粗糙 ， 無致病性 Griffith 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示意 混合培養(yǎng) RII型活菌 SIII型活菌 SIII型熱死菌 RII型活菌 SIII型活菌 健康 健康 健康 健康 健康 健康 健康 病死 病死 病死 （ 2） 細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) （ 3） S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn) 以上實(shí)驗(yàn)說明：加熱殺死的 SIII型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進(jìn)入 RII型細(xì)胞并使 RII型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)?SIII型細(xì)胞。 熱死 SIII菌 —————不生長 活 RII 菌 —————長出 RII菌 熱死 SIII菌 —————長出大量 RII菌和 106SIII菌 活 R菌 +S菌無細(xì)胞抽提液 ——長出大量 R菌和少量 S菌 +活 RII菌 平皿培養(yǎng) ① 加 S菌 DNA ② 加 S菌 DNA及 DNA酶以外的酶 ③ 加 S菌的 DNA和 DNA酶 ④ 加 S菌的 RNA ⑤ 加 S菌的蛋白質(zhì) ⑥ 加 S菌的莢膜多糖 活 R菌 長出 S菌 只有 R菌 1944年 、 M。 McCarty從熱死 S型 S. pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分 ，并在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)： 只有 S型細(xì)菌的 DNA才能將 S. pneumoniae的 R型轉(zhuǎn)化為 S型 。 且 DNA純度越高 ， 轉(zhuǎn)化效率也越高 。 說明 S型菌株轉(zhuǎn)移給 R型菌株的 ， 是遺傳因子 。 （ 二 ） 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) A. D. Hershey和 M. Chase， 1952年 （ 1） 含 32PDNA的一組：放射性 85%在沉淀中 10分鐘后 用搗碎器 使空殼脫離 吸附 離心 沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體 上清液中含 15%放射性 沉淀中含 85%放射性 沉淀中含 25%放射性 以 32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn) （ 2） 含 35S蛋白質(zhì)的一組：放射性 75%在上清液中 10分鐘后 用搗碎器 使空殼脫離 吸附 離心 沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體 上清液中含 75%放射性 （ 三 ） 植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) 為了證明核酸是遺傳物質(zhì) ， H. FraenkelConrat（ 1956） 用含 RNA的煙草花葉病毒 （ TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn) 。 將 TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩 ， 就能將其蛋白質(zhì)外殼與 RNA核心相分離 。 分離后的RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下 ， 也能感染煙草并使其患典型癥狀 ， 而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子 。 選用 TMV和霍氏車前花葉病毒（ HRV） ， 分別拆分取得各自的 RNA和蛋白質(zhì) ， 將兩種RNA分別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒： （ 1） RNA（ TMV） 蛋白質(zhì) （ HRV） （ 2） RNA（ HRV） 蛋白質(zhì) （ TMV） 用兩種雜合病毒感染寄主： （ 1） 表現(xiàn) TMV的典型癥狀病分離到正常 TMV粒子 （ 2） 表現(xiàn) HRV的典型癥狀病分離到正常 HRV粒子 。 上述結(jié)果說明 ， 在 RNA病毒中 ，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸 。 MTV HRV HRV MTV ?（一）核酸存在的七個(gè)水平及質(zhì)粒 ?細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核 ?細(xì)胞核水平 : 原與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外 DNA ?染色體水平 : 倍性 (真核 )和染色體數(shù) ?核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或 RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈 ?基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄 ——翻譯 ?密碼子水平： 信息單位 ,起始和終止 , ?核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基 二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式 三 、 原核生物的質(zhì)粒 ? 定義： 是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋 DNA分子，能獨(dú)立于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制。 ? 大?。?約為 2~100 106Dalton，上面攜帶有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因。 ? 性質(zhì)： ? ①可以在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體之外獨(dú)立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以 附加體（ episome） 的形式存在； ? ②質(zhì)粒是一種 復(fù)制子（ replicon） ，根據(jù)自我復(fù)制能力的不同，可把質(zhì)粒復(fù)制的控制形式分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種， 嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細(xì)胞核控制，與染色體 DNA復(fù)制相伴隨 ,一般一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)只有少數(shù)幾個(gè)（ 1~5）個(gè)拷貝； 松弛型質(zhì)粒 的復(fù)制不受細(xì)胞核控制，在染色體 DNA復(fù)制停止的情況下仍可以進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到 10~200個(gè)或更多。 ③ 可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)菌細(xì)胞中，使兩個(gè)細(xì)胞都成為帶有質(zhì)粒的細(xì)胞；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。 ④對(duì)于細(xì)菌的生存并不是必要的 ⑤功能多樣化 三、原核生物的質(zhì)粒 功能： 進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。 重組： 在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。 存在范圍 ：很多細(xì)菌如 、 Shigella、 、Streptococcus lactis、根癌土壤桿菌等 制備： 包括增殖、裂解細(xì)胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除 RNA和蛋白質(zhì)等步驟。 鑒定： 電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法 三、原核生物的質(zhì)粒 幾種代表性質(zhì)粒： ?1. F–因子（ fertility factor） ：又稱致育因子或性因子， 62 106Dalton， ，相當(dāng)于核染色體 DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼 94個(gè)中等大小多肽，其中 1/3基因（ tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。存在于腸細(xì)菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細(xì)菌中，決定性別。 Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes. 最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（ Shigella dysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于 Salmonella、 Vibrio、 Bacillus、 Pseudomonas和Staphylococcus中。 –R因子由相連的兩個(gè) DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（ resistence transfor factor， RTF ）和抗性決定 R因子（ rdeterminant）， RTF為分子量約為 11 106Dalton，控制質(zhì)粒 copy數(shù)及復(fù)制，抗性決定質(zhì)粒大小不固定，從幾百萬到 100 106Dalton以上。其上帶有其它抗生素的抗性基因。 –R因子在細(xì)胞內(nèi)的 copy數(shù)可從 1~2個(gè)到幾十個(gè)，分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)粒可達(dá)2022~3000個(gè) /細(xì)胞。 2. R因子（ resistence factor） ? 產(chǎn)大腸桿菌素因子。 ? 大腸桿菌素是由 ，能通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細(xì)菌。其分子量約 4 104~8 104Dalton。大腸桿菌素都是由 Col因子編碼的。 ? Col因子可分為兩類，分別以 ColE1和 ColIb為代表。 – ColE1分子量約為 5 106Dalton，無接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA 的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。 – ColIb分子量約為 80 106Dalton， 它與 F因子相似， 具有通過接合