基因芯片在食源性致病微生物檢測中的應用(編輯修改稿)
2025-05-01 23:18 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 敏感性高，對革蘭氏陰性和陽性菌同時適用，已用于水果、蔬菜、奶制品、魚類等多種動植物性食品的衛(wèi)生檢測。3 基因芯片用于食品微生物檢測的具體實例利用北京博奧公司開發(fā)的食源性致病微生物檢測試劑盒對鮮豬肉進行致病微生物檢測，該試劑盒可同時對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、致瀉性大腸桿菌O157:H空腸彎曲桿菌和金黃色葡萄球菌進行檢測，檢測靈敏度達，檢測的假陽性率為假陰性率為0%。Ⅰ、樣品的前增菌取25g鮮豬肉放入含有225mL營養(yǎng)肉湯（NB）的均質(zhì)杯中進行均質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入三角瓶中37℃培養(yǎng)10h，同時將另一份樣品經(jīng)同樣處理后于37℃微氧環(huán)境（5%O10%CO85%N2）增菌48h，該樣品用于空腸彎曲桿菌的檢測。Ⅱ、細菌基因組DNA提取利用博奧公司生產(chǎn)的通用型細菌DNA快速提取試劑盒對待檢測樣品進行基因組DNA提取，具體步驟參見：%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。Ⅲ、對多重不對稱PCR擴增PCR擴增參照試劑盒說明書進行，50 181。l PCR 體系中，10PCR Buffer 終濃度為dNTP mmolL標記濃度1181。molLLDNA 模板2 181。l，Taq 酶2U；退火溫度為52℃；循環(huán)程序為：94℃變性5 min 后進入PCR 循環(huán)，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 1min 40sec，擴增40 個循環(huán)后72℃延伸7 min。PCR %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。Ⅳ、雜交及結(jié)果判讀對具有擴增的樣品進行雜交檢測，在12 ul雜交體系中含有，20SSC終濃度為%SDS、25%甲酰胺、5Denhardt`s、42℃恒溫水浴雜交2小時后用2%SDS，42℃震蕩清洗4min,SSC 42℃震蕩清洗4min4 基因芯片在食品微生物檢測中的應用 基因芯片技術(shù)檢測食品常見致病菌基因芯片可以同時固定大量的探針分子，理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學指標，這為平行檢測多個菌種或同菌種內(nèi)多個菌株提供了一條便捷的途徑；同時檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發(fā)展前景。表2列出了近年來應用寡核苷酸芯片對進行微生物檢測與鑒定的一些進展。從表2 中可以看出,目前用于細菌檢測和鑒定的芯片所用探針大多來自于16SrRNA ,部分來自于一些功能基因。標記的方法仍然是以PCR 過程中進行標記為主。表2 應用寡核苷酸芯片進行病原體檢測及種類鑒定的部分研究進展檢測對象探針標記參考文獻大小(mer)來源20 種人腸道細菌4016S rDNAPCR 擴增樣品16S rDNA 全長時Taq 酶聚合摻入熒光物或地高辛[10]5 種較近親緣關(guān)系的桿菌≈2016S rRNA化學方法標記樣品16S rRNA 的PCR 擴增[11]玫瑰桿菌等6 種水表面細菌 15～2016S rRNA使用indocarbocyanine 和生物素標記的引物PCR 擴增樣品16S rRNA[12]雞糞便中的彎曲菌彎曲菌 27～3516S rRNA 與23SrRNA間區(qū)域及特有基因熒光引物PCR 擴增標記[13]30 種菌血癥血液中細菌 21～3123S rDNA地高辛引物PCR 擴增標記[14]大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌等14 種細菌 13～17gyrBPCR 擴增時Taq 酶聚合摻入熒光物[15]14 種分枝桿菌
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