基因芯片在食源性致病微生物檢測中的應用-wenkub
2023-04-19 23:18:35 本頁面
【正文】 88.1 Kakinuma K, Fukushima M, Kawaguchi R. Biotechnology Bioengineering , 2003 , 83 : 721～728.1Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H , et al . J Clinical Microbiology , 2003 , 41 : 2605～2615.1Volokhov D , Rasooly A , Chumakov K, et al . Clinical Microbiology , 2002 , 40 : 4720～4728.1Chizhikov V. Rasooly A. et al. Microarray Analysis of Microbial Virnlence Factors [J]. Appl Environ Micro :3258.1，王津，].臨床檢驗雜志，(3):133136。同時，在雜交體系中增加甲酰胺的濃度會增強反應特異性；探針長度也會影響反應的特異性，通常探針不要超過40個堿基，過長的探針會降低雜交的特異性。為了提高基因芯片檢測的靈敏度，一方面應在核酸提取前盡量除去基質(zhì)的污染，采用熒光素對引物末端修飾會比在PCR過程中摻入熒光素的方法產(chǎn)生更低的雜交背景，在靶核酸分子與芯片雜交前通過純化除去各種雜質(zhì)，這樣即可提高檢測的信噪比，又可防止雜質(zhì)污染芯片。從表2 中可以看出,目前用于細菌檢測和鑒定的芯片所用探針大多來自于16SrRNA ,部分來自于一些功能基因。l，Taq 酶2U；退火溫度為52℃；循環(huán)程序為：94℃變性5 min 后進入PCR 循環(huán)，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 1min 40sec，擴增40 個循環(huán)后72℃延伸7 min。L標記濃度1181。Ⅰ、樣品的前增菌取25g鮮豬肉放入含有225mL營養(yǎng)肉湯（NB）的均質(zhì)杯中進行均質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入三角瓶中37℃培養(yǎng)10h，同時將另一份樣品經(jīng)同樣處理后于37℃微氧環(huán)境（5%O10%CO85%N2）增菌48h，該樣品用于空腸彎曲桿菌的檢測。 微生物DNA的分離純化食品中微生物靶核酸濃度低、異質(zhì)性強，同時PCR擴增又對基因組DNA的純度要求高，因此分離純化微生物DNA是包括基因芯片技術(shù)在內(nèi)的食品基因分析檢測的難點。利用基因芯片技術(shù)檢測食品中的微生物首先需要對樣品進行富集培養(yǎng)，以增加樣品中微生物的絕對數(shù)量，以滿足低豐度微生物的檢測要求；食品衛(wèi)生檢測工作日常檢測的食品種類多、樣品數(shù)量大，因而在富集培養(yǎng)時，通常多采用對檢測目標菌株進行選擇性培養(yǎng)，以此來初步篩選及分離純化目標微生物，提高檢測的準確性。在標記靶標時，由于在PCR擴增時加入熒光標記的Dntp容易對后面的雜交產(chǎn)生高背景，所以目前多采用在引物末端進行熒光修飾的方法標記靶標，這樣獲得的PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化直接用于雜交檢測。 端氨基化修飾，以便與醛基包被的基片表面結(jié)合，從而將探針固定在基片上。16S rDNA 由可變區(qū)和保守區(qū)組成, 保守區(qū)為所有細菌所共有, 可變區(qū)在不同種屬間有不同程度差異, 可變區(qū)與保守區(qū)交錯排列。首先利用待檢測微生物的基因組序列設(shè)計針對各種微生物的特異探針，將該探針（寡核苷酸）點樣于芯片表面，同時在探針兩側(cè)設(shè)計PCR引物，在引物合成過程中對其5’端進行熒光標記或在PCR過程中加入熒光標記的dNTP，這樣利用PCR擴增的方法即可得到標記有熒光染料的待檢測微生物靶標，然后用含有待檢測樣品特異探針的微陣列芯片與標記的靶標雜交，熒光標記的DNA分子與芯片上相匹配的DNA序列發(fā)生雜交反應，使得芯
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