基因芯片在食源性致病微生物檢測中的應用-展示頁
2025-04-13 23:18本頁面
【正文】 是否存在某些特定微生物[5]。 芯片探針與PCR引物的設計、合成基因芯片檢測不同于傳統(tǒng)的基因分析方法，要求同時檢測數(shù)十種乃至上百種微生物的基因，從而對芯片探針及PCR 引物的設計提出了較高的要求。16S rDNA 由可變區(qū)和保守區(qū)組成, 保守區(qū)為所有細菌所共有, 可變區(qū)在不同種屬間有不同程度差異, 可變區(qū)與保守區(qū)交錯排列。但由于16S rDNA 的高度保守性, 探針的特異性設計比較困難, 常產(chǎn)生假陽性結果,對于某些16S rRNA序列基本相同的致病菌，可利用特異的致病基因，如沙門氏菌的invA 基因、大腸桿菌O157:H7 的23S rRNA 基因、志賀氏菌的virA 基因作為檢測靶基因設計引物和探針[7 ]。 端氨基化修飾，以便與醛基包被的基片表面結合，從而將探針固定在基片上。將預先人工合成的探針寡核苷酸探針按照合適的陣列分布和排列采用全自動點樣儀點制在玻片載體上，在對芯片進行預處理，除去芯片表面未結合的探針后即可進行雜交檢測。在標記靶標時，由于在PCR擴增時加入熒光標記的Dntp容易對后面的雜交產(chǎn)生高背景，所以目前多采用在引物末端進行熒光修飾的方法標記靶標，這樣獲得的PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化直接用于雜交檢測。芯片雜交信號的檢測一般均采用各種型號的芯片檢測儀測定芯片中各點陣的熒光強度，然后再用專門的分析軟件對結果進行分析和判讀。利用基因芯片技術檢測食品中的微生物首先需要對樣品進行富集培養(yǎng)，以增加樣品中微生物的絕對數(shù)量，以滿足低豐度微生物的檢測要求；食品衛(wèi)生檢測工作日常檢測的食品種類多、樣品數(shù)量大，因而在富集培養(yǎng)時，通常多采用對檢測目標菌株進行選擇性培養(yǎng)，以此來初步篩選及分離純化目標微生物，提高檢測的準確性。近年來，許多物理或化學分離純化方法被成功引進到食品微生物檢測工作之中。 微生物DNA的分離純化食品中微生物靶核酸濃度低、異質性強，同時PCR擴增又對基因組DNA的純度要求高，因此分離純化微生物DNA是包括基因芯片技術在內(nèi)的食品基因分析檢測的難點。北京博奧生物公司新近開發(fā)了一種專門針對細菌的通用型細菌DNA快速提取器，一次可同時處理36份樣品，自動化程度、敏感性高，對革蘭氏陰性和陽性菌同時適用，已用于水果、蔬菜、奶制品、魚類等多種動植物性食品的衛(wèi)生檢測。Ⅰ、樣品的前增菌取25g鮮豬肉放入含有225mL營養(yǎng)肉湯（NB）的均質杯中進行均質，然后轉入三角瓶中37℃培養(yǎng)10h，同時將另一份樣品經(jīng)同樣處理后于37℃微氧環(huán)境（5%O10%CO85%N2）增菌48h，該樣品用于空腸彎曲桿菌的檢測。Ⅲ、對多重不對稱PCR擴增PCR擴增參照試劑盒說明書進行，50 181。L標記濃度1181。Ll，Taq 酶2U；退火溫度為52℃；循環(huán)程序為：94℃變性5 min 后進入PCR 循環(huán)，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 1min 40sec，擴增40 個循環(huán)后72℃延伸7 min。Ⅳ、雜交及結果判讀對具有擴增的樣品進行雜交檢測，在12 ul雜交體系中含有，20SSC終濃度為%SDS、25%甲酰胺、5Denhardt`s、42℃恒溫水浴雜交2小時后用2%SDS，42℃震蕩清洗4min,SSC 42℃震蕩清洗4min4 基因芯片在食品微生物檢測中的應用 基因芯片技術檢測食品常見致病菌基因芯片可以同時固定大量的探針分子，理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學指標，這為平行檢測多個菌種或同菌種內(nèi)多個菌株提供了一條便捷的途徑；同時檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發(fā)
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