【正文】 凍與冷凍反復循環(huán)過程中 ， 樣品中的待測藥物含量會發(fā)生明顯降解現(xiàn)象 。 （ 五 ） 樣品的預處理及測定 樣品的處理：體液中的藥物由于體液中雜質(zhì)的干擾通常不能用儀器直接進行測定。這一過程稱為樣品測定前處理，即樣品的處理。 因此，在定量測定前，要對生物體液或組織中的待測成分進行分離和富集來提高分析測定的靈敏度。富集是指從大量基體物質(zhì)（生物體液或組織成分）中將待測量的組分集中到一較小體積溶液中，以提高檢測的靈敏度，因此生物組織中藥物測定的預處理關系到定量分析的專一性與靈敏度，是藥物分析的關鍵性步驟。 在定量分析中常用的分離方法包括：根據(jù)分子大小與幾何形狀或電荷進行分離的分子篩、凝膠滲透色譜、氣體擴散，膜滲析、電泳等分析；根據(jù)表面活性進行分離的吸附色譜，高效液相色譜、活性碳吸附方法；根據(jù)藥物的揮發(fā)性進行分離的蒸餾與揮發(fā)、升華、冷凍干燥，有機物灰化方法； 根據(jù)溶解度進行分離的沉淀 、 共沉淀 、 選擇溶解方法；根據(jù)分配平衡進行分離的溶劑萃取法 ， 固液萃取法 、 分配色譜法 、薄層色譜法以及根據(jù)離子交換平衡進行測定的無機和有機離子交換法等 。 (1)樣品分離回收率 在樣品預處理時 ， 通常用回收率 （ R） 來對其分離方效果進行評價 ， 其回收率定義如下： () 其中 ， 和 分別代表富集后和富集前待測藥物的量 。 在分析測定時 ， 回收率越高 ， 其分析方法結(jié)果的可靠性就越高 。 值得說明的是 ， 有時由于分離技術條件的限制 ， 造成回收率較低 （ 50%左右 ） ， 但如果分離的穩(wěn)定性 （ 重復性 ） 較好 ， 在分析中也是允許的 。主要注意如下幾方面的問題：選擇恰當?shù)姆蛛x方法；選擇最佳的萃取溶劑；在低溫條件下萃取 （ 例如通氮氣等 ） ， 防止藥物的氧化分解；增加萃取的次數(shù)等 。 除去血液中蛋白質(zhì)方法較多 ， 主要有溶劑沉淀法與加酶消化法 。 在血樣中加入有機溶劑 、 酸 、 鹽或重金屬離子可使血漿蛋白沉淀折出 。 某些試劑如酸類和重金屬鹽類可與血漿蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而發(fā)生沉淀 ，然后通過濾過方法除去沉淀蛋白質(zhì) 。 沉淀蛋白質(zhì)的酸類為陰離子型沉淀劑 ， 常見的有三氯乙酸 、 高氯酸 、 鎢酸等 。 酸類沉淀劑在低于蛋白質(zhì)等電點的 pH值時 ， 可與帶正電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽而發(fā)生沉淀 。 高氯酸沉淀蛋白質(zhì)時 ， 其酸根可通過加入鉀鹽而消除；三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)時 ， 再用乙醚萃取樣品中的藥物時 ， 由于三氯乙酸可溶于萃取溶劑乙醚中 ， 而干擾測定結(jié)果 。 血液包括血漿和血清 ， 實際上是一種膠體溶液 ，硫酸鈉 、 氯化鈉 、 硫酸銨等中性鹽可破壞該膠體體系中水化膜和改變蛋白質(zhì)表面電荷 ， 使膠體體系不穩(wěn)定而發(fā)生沉淀 。 在血液蛋白質(zhì)膠體溶液中 ， 也會使水的介電常數(shù)減小 ， 改變蛋白質(zhì)的電荷數(shù)而破壞水化膜 ， 增加蛋白質(zhì)顆粒靜電引力 ， 使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀 。 此時 ， 可用如石油醚 ， 正已烷等溶劑脫脂 ， 減少對其儀器測定 （ 如 HPLC） 的干擾 。 有時為了提高血樣與尿樣中藥物分離萃取的效率，需要將血樣中呈現(xiàn)結(jié)合狀態(tài)的藥物水解出來。 發(fā)生結(jié)合反應的藥物，其極性大大增強，水溶性增加，或在生理 pH值條件下電離度增加，不利于有機溶劑對樣品中藥物的萃取。 常用的方法有酸水解法 （ HCl） ， 酶水解法 （ β 葡萄糖醛酸甙酶 ， 芳香基硫酸酯酶 ） 和溶劑解三種 。 （ 3） 液 液萃取的原理與應用 血樣與尿樣中藥物組分的分離最常用的方法是液 — 液萃取法 。 ① 分配系數(shù) 液 — 液萃取也叫溶劑萃取。當分配達到平衡時，待測藥物組分在兩個溶劑中的濃度比在一定的溫度條件下和 pH值條件下為一常數(shù)。 ]/[][ 水非 AAk d ?② 分配比 在液 — 液萃取過程中 ， 藥物在水相和非水相中常以多種形式存在 ， 如離解態(tài) ， 聚合態(tài) ， 絡合態(tài)或與其他組分發(fā)生化學反應等等 。 在藥物分析時 ， 實際最注重考慮的是藥物在兩相中的總濃度 ， 很少考慮各種形式的濃度 。 水非水水水非非非][][][][][][][][2121CCAAAAAADnn ?????????? 值得說明的是只有當藥物在兩相中的存在形式完全相同時 ，分配比 D才等于分配系數(shù) kd。 設 V非 和 V水 分別為萃取時有機相 （ 非水相 ） 和水相的體積 ，[C]非 和 [C]水 分別代表藥物在非水相和水相中的濃度 ， 則萃取率為 100][][ ][100% ???? ????水水非非非非藥物在兩相中的總量藥物在有機相中的總量VCVCVCE根據(jù) D=[C]非 /[C]水 可知 （ ） 當非水相和水相的體積相等時 ， 則有 E%=D（ D+1） 100 100)/(% ???非水VVDDE 根據(jù)上述關系可知當分配比分別為 100和 1000時 ， 其相應的萃取率為 50%、 91%、 99%和 %。 在實際工作中 ， 如果 D值不充分大時 ， 應該分次加入有機溶劑進行多次連續(xù)萃取 ， 以提高其萃取分離的效率 。 ④ 影響萃取分離的因素 影響藥物萃取率的因素包括萃取系統(tǒng)的酸堿度 （ pH值 ） 、 藥物的電離速率常數(shù) （ pKa值 ） 以及萃取所選擇的有機相 、 萃取時間及其溫度等 。根據(jù)這一特點，可使用酸或堿使藥物轉(zhuǎn)化成相應的鹽而溶于極性溶劑水中，再調(diào)節(jié)樣品的 pH值，使離子型藥物轉(zhuǎn)變成非電離型（分子型）而溶于非極性溶劑中。根據(jù)化學原理可知，當水相 pH=pKa值時，有 50%的藥物以非電離形式存在。 例如苯巴比妥的 pKa值為 。被有機溶劑提取的比例不高。 值得注意的是上述這一規(guī)則對于高度電離的極性化合物 ，如季銨鹽類 （ 氨基甙類抗生素 ） 或具有兩性化合物性質(zhì)的藥物（ 四環(huán)素類藥物 ， 磺胺類藥物 ， 氟喹諾酮類藥物 ） 以及有形成兩性離子傾向的化合物并不適合 。 可采用離子對技術提取和定量 。 酸性藥物萃取的 pH值應低于其 pKa值 23個單位 。 提高其萃取的回收率 。 液 — 液萃取常用的有機溶劑見表 112。通常液 液萃取的水相就是生物樣品相 （ 血漿 、 血清 、 尿液 ） 。 選擇有機相的基本原則是： 滿足萃取的需要 ， 盡可能提高其萃取率 ， 即選擇對被提取物有較大親合力 ， 與水互不相溶的有機溶劑 。 Al2O3） UV截止波長 （ nm） 水中溶解度 （ %（ W/W）20℃ ） 沸點 （ ℃ ） 正已烷 190 69 異辛烷 197 99 環(huán)已烷 200 81 四氯化碳 265 77 甲苯 285 110 乙醚 218 35 苯 280 80 烷 230 83 氯仿 245 61 二氯甲烷 233 40 乙酸乙酯 256 77 丙酮 330 互溶 56 乙腈 190 互溶 82 異丙醇 205 互溶 82 乙醇 210 互溶 78 甲醇 205 互溶 65 —— 引自姚彤煒 . 體內(nèi)藥物分析 ， 浙江大學出版社 ， 2021年 3月版 ， 53頁 . 離子強度： 在水相中加入水溶性強的中性鹽如硫酸鈉 、 氯化鈉 、 硫酸銨等 ， 可以增加離子強度 ， 使溶液中水分子與無機離子強烈締合 ， 導致藥物在水相中的溶解度下降 。 加入無機鹽還能減少藥物在有機溶劑與水相間提取時發(fā)生乳化 ， 有利于提取的操作 。 萃取的時間決定于藥物在有機相達到分配平衡的速度 ， 通常為 1分鐘到數(shù)分鐘不等 。 洗滌：在液 — 液萃取過程中 ， 血液中的干擾組分也可能進入有機相中 ， 當干擾組分的分配比較小時 ， 可用洗滌的方法除去 。 （ 在樣本為血清或血漿時 ， 洗滌液即為空白血清或空白血漿 ） 。 ⑥ 液 — 液萃取問題及處理方法 在萃取過程中 ， 萃取液靜置分層時 ， 在兩相交界處有時會出現(xiàn)一層乳濁液 ， 有時整個兩相液體全部發(fā)生乳化 ， 造成水相與有機相分離不全或完全不能分離 ， 此時可采用下列方法進行處理： 增大有機溶劑用量； 萃取前在水相中加入適量電解質(zhì)如氯化鈉 ， 減輕乳化程度； 改變?nèi)芤旱?pH值 ， 避免在過高 pH值條件下從水相中提取藥物； 避免使用容易發(fā)生乳化的溶劑對 ， 如水與已烷 ， 水與苯 ， 選用具有高的界面張力和密度差異大的溶劑 。 加乙醇或少量高級脂肪酸 ， 改變表面張力 ， 以利于破壞乳化 。 也可用含 10%的二甲基二氯硅烷的甲苯溶液充滿干燥玻璃試管 ， 放置 30分鐘傾出 ， 依次用甲苯 、 甲醇淌洗 ，然后烘干備用 。 ⑦ 液 — 液萃取的應用 藥物動力學研究中，體液中藥物的定量分析前的分離與富集最常用的方法就是液 — 液萃取。然而，隨尿排出的嗎啡，只有 15%游離的， 85%是與葡萄糖醛酸結(jié)合成酯。 因此 ， 在萃取前 ， 應將尿液用硫酸酸化 ， 并在約 90℃ 加熱 15分鐘 。 使嗎啡游離出來 。 因此 ， 萃取物應通過反萃取使嗎啡進入稀鹽酸中 ， 讓其他干擾物質(zhì)存留于有機相 ， 而達到提純嗎啡的作用 。 再用氣相色譜法測定其含量 。 諾氟沙星 血清、乳汁 2ml萃取 ， 在旋渦振蕩儀上振蕩 15秒鐘后在 3000 g速度下離心 10分鐘 。 體液中藥物定量分析 常見的分析方法有光譜法 、 免疫分析法 、 色譜法 、 手性色譜法 、 毛細管電泳法以及儀器分析聯(lián)用技術 。 近年來發(fā)展的光譜和放射性同位素等儀器分析方法 ， 有檢測的靈敏度高 ， 特異性好優(yōu)點 ， 特別適合于樣品中微量藥物分析 。 包括檢測限 、定量限和最低檢測濃度 。 常以被測信號和背景噪音比 S/N為 2～ 3倍時的被測藥物的絕對量來表示 ， 其 N表示噪音 ， S表示單位重量被測藥物的信號 。 最小檢測濃度等于定量限除以進樣體積 。 常以標準曲線的最小濃度點作為定量限 。 在進行生物利用度和生物等效性研究時 ， 要求定量限至少能滿足測定 3～ 5個半衰期時樣品中的藥物濃度 ， 或最大血藥濃度的 1/10～ 1/20時的藥物濃度 。 表 116 體液中藥物定量分析方法比較表 檢 測 方 法 檢出限（ ng） 專 一 性 比色法 1000 – 紫外分光光度法 100 – 熒光分光光度法 1 +– 原子吸收分光光度法 1 – 薄層掃描法 紫外掃描 10 ++ 熒光掃描 1 ++ 氣相色譜法