【正文】 ，闡述中成藥微生物限度檢查的四種方法 (常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法和薄膜過濾法 )中常規(guī)法的特點(diǎn)和操作步驟，同時(shí)對(duì)其適用性以及影響因素進(jìn)行考察。 陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 1 1 第一章 前 言 藥品是一種關(guān)乎人類身體健康的特殊商品，一生中從不使用藥 品的人是鳳毛麟角的。因此，藥品質(zhì)量的重要性不言而喻。否則，治病的藥品就會(huì)變成致病，甚至是致命的“毒藥”。事實(shí)上，由于藥品染菌引起使用者感染以至造成嚴(yán)重后果的事件屢有報(bào)道。這方面還有更多的例證，例如由于滴眼劑污染銅綠假單胞菌，導(dǎo)致病人發(fā)生角膜潰瘍的事例、因使用污染破傷風(fēng)梭菌的婦科用藥引發(fā)破傷風(fēng)癥而死亡的事例、 2020 年導(dǎo)致 11人死亡的“欣氟”事件、 2020 年導(dǎo)致云南省 6 名患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，其中死亡 3 例的“刺五加注射液”事件等等，都是由于微生物污染藥品引起的。因 此，藥品的染菌程度檢查和安全性評(píng)價(jià)應(yīng)當(dāng)?shù)玫饺藗兊闹匾?，而藥品微生物檢驗(yàn)就是藥品染菌程度和安全性評(píng)價(jià)的重要技術(shù)手段之一。中藥在中醫(yī)臨床理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)下，在我國應(yīng)用了幾千年，對(duì)促進(jìn)中華民族的繁衍和保證人民的健康作出了巨大貢獻(xiàn)。 陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 2 2 中藥安全性問題究其來源是多方面的，主要與中藥本身特性、應(yīng)用環(huán)境、辨證論治、種植和炮 制的管理、患者體質(zhì)和藥品受污染程度等相關(guān) [2]。微生物檢驗(yàn)分為強(qiáng)制性的無菌檢查 (要求不能檢出 )和非強(qiáng)制性的限度標(biāo)準(zhǔn)檢查 (允許有一定數(shù)量的菌，微生物限度 )。 微生物限度標(biāo)準(zhǔn)在我國的發(fā)展 我國開展藥品微生 物檢驗(yàn)始于 1972年，至今已有三十多年的歷史。 1978 年國家衛(wèi)生部、化工部、商業(yè)部聯(lián)合頒發(fā)了我國第一個(gè)《藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》 [1][3]，該標(biāo)準(zhǔn)主要為中藥和化學(xué)藥，并按丸劑、片劑、散劑、沖劑及糖漿、合劑、水劑等劑型規(guī)定了微生物限度，包括細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)的不同規(guī)定。上世紀(jì) 70 年代中后期，國內(nèi)先后在武漢、宜昌等地因使用中藥散劑治療宮頸糜爛發(fā)生了多起 事故，經(jīng)查證為藥物污染破傷風(fēng)梭菌所致。 1986 年衛(wèi)生部頒發(fā)了經(jīng)修改的《藥品衛(wèi)牛標(biāo)準(zhǔn)》， 1989 年又下達(dá)了《藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充規(guī)定和說明》。之后的《中國藥典》 1995年版 [5]收載了微生物限度檢查法，并對(duì)少數(shù)劑型收載了微生物限度，但大多 數(shù)劑型仍未有微生物限度的規(guī)定。未列入標(biāo)準(zhǔn)的劑型，則根據(jù)用藥途徑，參照同類劑型的微生物限度作了補(bǔ)充，如滴耳劑、滴鼻劑等。 由此可見，藥品的微生物檢查是 隨著人們對(duì)藥品污染問題認(rèn)識(shí)的提高，在吸取了事故甚至是生命的教訓(xùn)后建立起來，并不斷補(bǔ)充完善的藥品質(zhì)量控制科目，而且必將繼續(xù)得到發(fā)展。 細(xì)菌數(shù)測定 藥品細(xì)菌數(shù)測定是微生物的定量檢查，是用來判斷藥品被細(xì)菌污染程度和衛(wèi)生質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，也是檢測中藥藥品質(zhì)量的指標(biāo)之一。按我國藥典規(guī)定，細(xì)菌計(jì)數(shù)是在需氧的條件下，溫度 30～ 35℃，一般培養(yǎng)48 小時(shí)，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長的細(xì)菌菌落數(shù)。細(xì)菌計(jì)數(shù)以菌落數(shù)為單位，即cfu(colony forming units)。受到真菌污染的藥品不僅可能導(dǎo)致變質(zhì)，還可能因其產(chǎn)生的代謝物以及各種真 菌毒素，使服用該藥品的患者產(chǎn)生急性或慢性的中毒病癥，有的真菌毒素甚至可導(dǎo)致或誘發(fā)癌癥 [8]。我國藥典采用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行各種制劑的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測定，當(dāng)制劑中含有蜂蜜和王漿時(shí)，需采用酵母浸出粉胨葡萄糖 (YPD)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)測定。 《中國藥典》的控制菌包括以下幾種： 大腸埃希菌 口服制劑、眼部給藥制劑、鼻及呼吸道給藥制劑以及直腸給藥制劑都需要控制大腸埃希菌，每 lg 或 lml 或 10cm2 均不得檢出。大腸埃希菌隨糞便排出體外，在土壤和水中如未被裂解可存活數(shù)天，在沃土表層則可存活更長時(shí)間，有可能污染水、食品、藥品等。中國藥典采用 MUG— Indole 法 [9][10]進(jìn)行大腸埃希菌的檢查。它不僅包括埃希菌屬中的某些細(xì)菌，還包括腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬及克雷伯菌屬中的某些細(xì)菌 [11]。大腸菌群不僅可指示大腸埃希菌等受外界環(huán)境影響較大的近期污染細(xì)菌是否存在，而且能反映如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌等受外界影響較小的遠(yuǎn)期污 染細(xì)菌是否存在。 沙門氏菌 沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌。因此，藥典規(guī)定，含動(dòng)物組織 (包括提取物 )及動(dòng)物類原材料 (蜂蜜、王漿、動(dòng)物角及阿膠除外 )的口服制劑每 10g 或 10ml 不得檢出沙門氏菌。廣泛分布于自然界，也存在于人和動(dòng)物皮膚及與外相通的腔道中。50％的人可攜帶致病性葡萄球菌。葡萄球菌屬是無芽孢細(xì)菌中抵抗力最強(qiáng)的細(xì)菌，耐干燥，對(duì)多種消毒劑不敏感。 銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌為假單胞菌屬的模式菌，習(xí)慣稱為綠 膿桿菌。 [12]目前，因?yàn)槠湮廴舅幤芬鹚幵葱约膊『歪t(yī)療事故的例子時(shí)有發(fā)生，所以加強(qiáng)對(duì)該菌的控制是必要的。本菌除在硝酸鹽培養(yǎng)基以外都是專性好氧。人和家畜及昆蟲的腸道內(nèi)亦存在該類微生物，可隨糞便排泄，污染土壤和水源。其芽孢體可耐高溫及干燥，有些菌的芽孢體 可在土壤中存活數(shù)十年。所以，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意嚴(yán)格控制環(huán)境中的含氧量。 微生物限度檢查的方法 微生物限度檢查方法按其研究內(nèi)容的不同，方法也不盡相同。由于藥品細(xì)菌數(shù)測定是活菌計(jì)數(shù)，所以最常用的是平皿法?？刂凭鷦t根據(jù)所需檢查菌種的不同而采取不同的檢查方法。這是由于藥品本身可能含有抑菌作用的組成及防腐劑等組分，一般認(rèn)為，這些組分在一定濃度下對(duì)微生物具有抑制或殺滅的作用，被抑制的微生物將因受到不同程度的損傷而可能影響檢查的準(zhǔn)確性[14]。 微生物檢測時(shí)，首先要進(jìn)行供試品溶液的制備。如水溶性供試品可直接加入稀釋劑；不溶于水的固體制劑采用勻漿或加陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文 6 6 混懸劑制成均勻的混懸液；非水溶性油劑或軟膏劑加入乳化劑 使之成為均勻分散的乳濁液；有抑菌成分的供試品加入消除抑菌成分的中和劑，以及采用離心沉淀和薄膜過濾等消除抑菌成分的方法等。該方法測定結(jié)果只反映在規(guī)定的條件下所生長的細(xì)菌 (嗜中溫、需氧和兼性厭氧 )、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)，不包括對(duì)營養(yǎng)、氧氣、溫度、 pH 值和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。它是用一定培養(yǎng)基在規(guī)定條件下培養(yǎng)后在固體平 板上呈現(xiàn)可見菌落，按規(guī)定方法計(jì)數(shù)報(bào)告的方法。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出供試品中的含菌數(shù)。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。 由于供試品本身的性質(zhì)、所采用的輔料、賦形劑以及劑型的不同，所使用的微生物限度檢查法也不盡相同。 針對(duì)本論文藥品采