【正文】 置錐形瓶中，加稀釋劑至 100ml，混勻后，作為供試液（ 1： 10）。每 1ml 供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為 1ml 的菌落數(shù)。 離心沉淀集菌法：取一定量的供試液， 3000 轉 /分離心 20 分鐘（供試液如有沉淀，先以 500 轉 /分鐘離心 5 分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約 2ml，加稀釋液補至原量。 方案編號： JiLinGuoYuan 微生物限度檢驗方法 驗證方案 第 6/16 頁 中和法：選 取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當?shù)膶Π被郊姿?，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉 半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80（ 3%）或卵磷脂（ 3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（ %）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。采用平皿法，取試驗用的 1ml 菌液（約 50～ 100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。 培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級 1ml 供試液分別注入 N 個平皿中，每個平皿再注入 50～ 100cfu 試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。 供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。 回收率計算 試驗組回收率計算 試驗組的菌回收率＝ 試驗組的菌回收率 供試品對照組平均菌落數(shù) 100% 菌液組的平均菌落數(shù) 稀釋劑對照組回收率計算 方案編號： JiLinGuoYuan 微生物限度檢驗方法 驗證方案 第 7/16 頁 試驗組的菌回收率＝ 稀釋劑對照組平均菌落數(shù) 100% 菌液組的平均菌落數(shù) 計數(shù)方法驗證至少應進行 3 次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率） ≥70%。 當建立藥品的微 生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。 菌液制備 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至 10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 35～ 37℃ 培養(yǎng) 18～ 24 小時；分別取培養(yǎng)液 1ml 加 %無菌氯化鈉溶液，采用 10 倍遞增稀釋法，稀釋至 105～ 107，制成每 1ml 含菌數(shù) 10～ 100cfu 的菌懸液。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。 試驗組 常規(guī)法 方案編號： JiLinGuoYuan 微生物限度檢驗方法 驗證方案 第 8/16 頁 大腸埃希菌 取相當于 1g 或 1ml 供試品的供試液至 100ml 膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌 10～ 100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～ 100cfu， 35～ 37℃培養(yǎng) 18～ 24 小時，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查 SOP》大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。 沙門菌 取供試品 10g 或 10ml，直接或處理后接種至適量（不少于 200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10～ 100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～ 100cfu， 35～ 37℃ 培養(yǎng) 18～ 24 小時。 銅綠假單胞菌 取相當于 1g或 1ml 供試品的供試液至 100ml 膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌 10～ 100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～ 100cfu， 35～ 37℃培養(yǎng) 18～ 24 小時。 金黃色葡萄球菌 取相當于 1g 或 1ml 供試品 的供試液至 100ml 膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～ 100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～ 100cfu， 35～37℃ 培養(yǎng) 18～ 24 小時。 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由 1： 100 放大到 1： 300、 1：500 或 1： 1000，由于容器體積限制，一般放大到 500ml 或 1000ml，本法適用于抑菌作用不強的樣品。 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以 500 轉 /分鐘離心3~5 分鐘，取全部上清液，再以 3000 轉 /分離心 20 分鐘，取下面