【正文】 血凝試驗（hem agglutination test）是紅細(xì)胞凝集試驗的簡稱。（方法步驟見肥達(dá)試驗） 二 間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的與免疫特異性無關(guān)的顆粒性載體的表面，形成人工的免疫微球（或致敏載體），然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination）或被動凝集反應(yīng)（passive agglutination）。臨床上常用的直接試管凝集試驗為肥達(dá)試驗（Widal test）和外斐試驗（WeilFelix test）。 （二）試管凝集試驗試管凝集試驗（tube agglutination test）為半定量試驗，在微生物學(xué)檢驗中常用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價（titer），亦稱為滴度。2．在載波片兩端涂布細(xì)菌時，應(yīng)先涂生理鹽水一側(cè)，后涂診斷血清一側(cè)，以免將血清誤帶入生理鹽水一側(cè)3．試驗后的細(xì)菌仍有傳染性，應(yīng)將玻片放入消毒缸內(nèi)4．若作ABO血型鑒定，室溫過低（－10℃以下）可出現(xiàn)冷凝集，造成假陽性結(jié)果。如與對照測相同不發(fā)生凝集則為陰性。 將玻片輕輕晃動，室溫下觀察結(jié)果， 【結(jié)果分析】 生理鹽水對照測不出現(xiàn)凝集，為均勻混濁的乳狀液。 用接種環(huán)按無菌操作取生理鹽水和已知診斷血清各2環(huán)分別置于左右格內(nèi)?！酒鞑脑噭?．標(biāo)本 任一常見細(xì)菌的平板或斜面培養(yǎng)物；待測血清2．試劑 與細(xì)菌相對應(yīng)的診斷血清（可用生理鹽水作適當(dāng)稀釋，以免發(fā)生前帶現(xiàn)象）、生理鹽水、已知沙門傷寒菌菌體抗原懸液（7108/ml）、傷寒沙門菌O抗血清。此法簡便、快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型。一般是用1滴已知診斷血清與1滴受檢菌液或細(xì)胞懸液，在玻片上混勻后，短時間內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。通過以下實驗的實踐，掌握各種凝集反應(yīng)的原理，熟悉方法步驟、結(jié)果判斷以及注意事項。由于凝集反應(yīng)方法簡便，敏感度高，因而在臨床檢驗中被廣泛應(yīng)用。反應(yīng)過程可分為兩階段：①抗原抗體的特異結(jié)合；②出現(xiàn)可見的顆粒凝集。 實驗二 凝集反應(yīng) 細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在的條件下，可逐漸聚集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。由于免疫期限及間隔時間較長，要注意脫敏，尤其在進(jìn)行靜脈免疫時。加強免疫的劑量一般為首次劑量的1/5～2/5。由于佐劑具有緩釋作用，于佐劑一起免疫的抗原可隔1～2周。注射完畢后，剩余佐劑抗原置4保存。佐劑與抗原混合研磨時，應(yīng)充分乳化，否則難以達(dá)到預(yù)期的免疫效果。在細(xì)菌性抗原制備過程中，應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，保證其純度和避免對實驗者的感染。為了避免個體差異，每種抗原最好免疫3只以上動物?！咀⒁馐马棥縿游锏倪x擇 免疫血清的制備多選用家兔為免疫對象，若系大量制備或二抗種屬特異性的需要，也可選用羊或馬。此外，抗血清的外觀應(yīng)該為澄清，力求無溶血?！窘Y(jié)果分析】抗原免疫動物后獲得的抗血清，效價可用上述相應(yīng)試驗判斷；其特異性則可通過雙擴，免疫電泳或交叉凝集試驗進(jìn)行考察。除鹽后的球蛋白過陰離子交換柱（DEAE纖維素），根據(jù)不同類別免疫球蛋白的等電點，選用不同pH和離子強度的緩沖液分別洗脫之；高滲或風(fēng)于法濃縮免疫球蛋白，若使用冷凍干燥器則可獲得干燥制品。4．抗血清的純化 更加精細(xì)的免疫試驗需要從抗血清中提取免疫球蛋白，此過程稱為抗血清的純化。酶免疫測定、放射免疫分析及平衡透析等方法，可用于抗體的特異性和親和力測定。針對顆粒性抗原的免疫血清效價，可通過凝集或溶細(xì)胞試驗（如溶血素效價滴定）檢測。⑸ 抗血清采集：頸動脈放血或心臟采血獲得的兔血，置37℃促進(jìn)血塊收縮，并用毛細(xì)吸管吸取血清，經(jīng)3000r /min離心去除殘留的紅細(xì)胞。試血時，環(huán)狀沉淀測定的抗體效價達(dá)到1:5000，雙向瓊脂擴散試驗效價達(dá)到1:16以上即可放血收集血清。⑶ 無佐劑的人血清加強免疫：上述免疫一周后，耳靜脈注射人血清（1:2稀釋） 左右以加強免疫,如此重復(fù)1～2次，并于最后一次注射一周后采血。 ,每只家兔注射量1ml。另外，也可將佐劑置磁力攪拌器上，邊攪拌，邊滴加抗原并繼續(xù)攪拌，使其完全乳化。若系不完全佐劑，則像加入人全血清那樣，按2～20mg/ml的量加入卡介苗。將稀釋血清按與完全佐劑1:1體積的比例混合，制成油包水狀態(tài)。⑷ 放血：勁動脈放血（也可心臟采血），以最大限度的獲得血清。⑵ 傷寒沙門菌O 抗原免疫方案：用于免疫動物的菌液濃度視菌種的不同而異，傷寒沙門菌、志賀痢疾菌等腸道桿菌，免疫濃度多為109個/ml左右。將濾過的菌液接種少量于瓊脂平板進(jìn)行無菌試驗（37℃，24h），確定無菌后用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至109個/ml，此為細(xì)菌O抗原，置4℃保存?zhèn)溆谩?、鑷子、注射器、研缽、試管等器材和冰箱、離心機等儀器 。②福氏完全佐劑：于不完全佐劑中加入卡介苗2～20mg/ml，研缽中研磨乳化后即為完全佐劑，冰箱保存?zhèn)溆谩? 【器材試劑】 細(xì)菌菌種(傷寒沙門菌O901)、混合人全血清、健康家兔?！緦嶒炘怼? 用抗原刺激機體可以使機體產(chǎn)生抗體，抗原與抗體是一對概念，抗原的純度和活性，影響著其免疫動物后獲得的抗體的特異性和滴度?？贵w制備的方案視抗原的性質(zhì)不同而異。 抗體的制備大致包括三個階段，即抗原的制備與純化、動物免疫和血清分離純化與鑒定。在傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法中，尤其是作細(xì)菌的血清學(xué)鑒定時，抗血清即能滿足要求，無需純化，因為純化的過程將造成免疫球蛋白的丟失?？芍苯討?yīng)用于病原的診斷或感染性疾病的緊急預(yù)防和治療；也可通過純化血清中的免疫球蛋白來制作多種與免疫相關(guān)或不相關(guān)疾病的診斷和治療制劑。12．認(rèn)真填寫實驗記錄，按時提交實驗報告。服從衛(wèi)生值日安排，認(rèn)真負(fù)責(zé)地做好清潔衛(wèi)生。10．實驗結(jié)束后，應(yīng)清理實驗用品，物歸原處。8．實驗室內(nèi)禁止吸煙、進(jìn)食、飲水、用嘴習(xí)習(xí)管及濕潤標(biāo)簽，不準(zhǔn)隨地吐痰。如將儀器、器材損壞，應(yīng)及時報告教師，并登記備案。5．實驗所用的儀器、器材和試劑須按照要求擺放，嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行操作，保證實驗過程順利進(jìn)行，并取得預(yù)期結(jié)果。3．仔細(xì)、耐心地觀察實驗過程中出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，及時、真實客觀地記錄實驗結(jié)果，并積極思考，認(rèn)真分析，得出結(jié)論。2．注意保持科學(xué)實驗的嚴(yán)肅性、嚴(yán)格性和嚴(yán)密性。目的在于激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新性思維，培養(yǎng)學(xué)生的科研能力，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。通過綜合性實驗，進(jìn)一步訓(xùn)練學(xué)生對所學(xué)知識和實驗技術(shù)的綜合運用能力、獨立工作能力和對實驗結(jié)果的綜合分析能力。1．基礎(chǔ)性實驗 要求學(xué)生系統(tǒng)學(xué)習(xí)和掌握常用的經(jīng)典免疫學(xué)實驗方法和現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)，使學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識，掌握相應(yīng)的實驗方法和實驗技能。實驗教學(xué)作為免疫學(xué)教學(xué)的重要環(huán)節(jié)，直接影響大人才的培養(yǎng)目標(biāo)的實現(xiàn)，特別是在培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、實踐技能、創(chuàng)新能力方面，具有重要的地位。它與分子生物學(xué)一樣是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床工作不可缺的工具。目前免疫學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入了一個嶄新的時代。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗技術(shù)概 述免疫學(xué)是一門既古老又嶄新的學(xué)科，涉及醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，并與理工農(nóng)各學(xué)科相互滲透。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是生命科學(xué)的前沿學(xué)科，也是醫(yī)學(xué)生的主干必修課程之一?，F(xiàn)代免疫學(xué)的研究和應(yīng)用涉及到生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是一門實踐性、應(yīng)用性很強的學(xué)科，教學(xué)過程分為理論教學(xué)和實驗教學(xué)。一醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗?zāi)康呐c要求 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗課程的開設(shè)，目的在于不僅使學(xué)生驗證部分理論知識和加深對課堂講授內(nèi)容的理解，更重要的是在掌握系統(tǒng)理論知識的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)和掌握免疫學(xué)實驗的基本技術(shù)和技能，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析和解決問題的能力，以及嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度和創(chuàng)新精神，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。2．綜合性實驗 實驗內(nèi)容涉及本課程的綜合知識或相關(guān)課程知識的實驗，往往由多種實驗手段、技術(shù)和層次的實驗內(nèi)容所組成。3．設(shè)計性實驗 是在完成基礎(chǔ)性試驗和綜合性試驗的基礎(chǔ)上，給定實驗?zāi)康?、要求和所提供的實驗條件，由學(xué)生自行查閱資料，自選題目、設(shè)計實驗方案，并在老師指導(dǎo)下，進(jìn)行試驗，最后以論文形式寫出實驗報告。二醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗室規(guī)則1．學(xué)生在上實驗課前，應(yīng)對實驗內(nèi)容進(jìn)行預(yù)習(xí)，明確實驗?zāi)康?、要求，了解實驗原理和操作步驟，熟悉所要使用的儀器、藥品的性質(zhì)和注意事項，預(yù)測實驗結(jié)果。實驗過程中，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真地觀察教師的演示，嚴(yán)肅認(rèn)真地按規(guī)定步驟進(jìn)行操作。4．積極參與小組設(shè)計實驗，樹立團隊精神，并發(fā)揮自己的聰明才智，創(chuàng)造性地開展科學(xué)實驗。6．要愛護公共財物，節(jié)約試劑材料，不得將實驗室任何物品私自帶走。7．實驗室內(nèi)應(yīng)保持安靜，遵守紀(jì)律，不得高聲談笑、隨便走動、玩弄動物。9．如有傳染性材料、有毒材料流灑與桌面、地面或衣服上，或發(fā)現(xiàn)割破皮膚、被動物咬傷等意外時，要及時報告教師，做好妥善處理。實驗廢棄物應(yīng)放入或倒入指定的地方或容器內(nèi)。11．離開實驗室前應(yīng)洗手，注意關(guān)好水、電、門、窗等。第一章基礎(chǔ)性試驗 實驗一 免疫血清的制備免疫血清是機體受到抗原物質(zhì)刺激后的血清，含有特異性免疫球蛋白。免疫血清又稱抗血清或抗體，而從抗血清中純化的免疫球蛋白則只能稱為抗體。但在現(xiàn)代免疫學(xué)方法中，由于免疫標(biāo)記和反應(yīng)精確度的需要，必須純化抗血清的有效成分，即獲得免疫球蛋白甚至是某一類或亞類的免疫球蛋白?？乖侵苽淇贵w的先決條件，要制備高質(zhì)量的抗體，必須首先獲得特異性高的抗原性物質(zhì)?！灸康囊蟆勘緦嶒炛苽淇谷巳搴蛡抽T菌O抗體,要求掌握免疫血清制備的原理及其方法步驟。根據(jù)抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律，視抗原的性質(zhì)選擇不同的途徑免疫動物，經(jīng)初次、再次免疫的過程，使得動物血清中產(chǎn)生足量的特異性抗體，繼而分離血清并純化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗體。 ①福氏不完全佐劑：稱取羊毛脂5g，逐滴加入石蠟油20ml（羊毛脂:石蠟油可為1:1～1:4），高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。、麥?zhǔn)媳葷峁?、甘油、防腐劑（％％硫柳汞）等?！痉椒ú襟E】 抗體的制備⑴ 傷寒沙門菌O 抗原的制備：經(jīng)革蘭染色作細(xì)菌純度鑒定的傷寒沙門菌O901，密集劃線接種于普通瓊脂平板（若需大量制備，可接種于用柯氏瓶制備的瓊脂培養(yǎng)基），37℃培養(yǎng)24～48h后，用生理鹽水將細(xì)菌菌苔洗于清潔、無菌的三角燒瓶中，置60℃水浴或隔水煮沸1h以破壞細(xì)菌的鞭毛，用濾紙過濾（大量制備時）或移入離心管4000r/min離心10～20min（少量時）。若制備鞭毛抗原，則可用含有5％石炭酸（苯酚）的生理鹽水洗下瓊脂平板上的菌苔，37℃溫育48h后作無菌試驗，濾過后用生理鹽水配成一定濃度。細(xì)菌性抗原的免疫方案大致相同，見表1—1 表1－1 傷寒沙門菌O抗原的免疫方案免疫日期（天）免疫途徑抗原免疫劑量（ml）1多點皮內(nèi)傷寒沙門O抗原6靜脈傷寒沙門O抗原11靜脈傷寒沙門O抗原16靜脈傷寒沙門O抗原19靜脈傷寒沙門O抗原 ⑶ 試血：末次免疫7d后即可試血，耳靜脈或心臟采血，分離血清與傷寒沙門菌O抗原作試管凝集試驗，凝集效價（滴度）在1:1600～3200之間時即可放血，若效價較低可繼續(xù)加強免疫。⑴ 抗原福氏完全佐劑：取混合人全血清，用生理鹽水作1:4稀釋。具體方法如下：1)研磨法：取完全佐劑置于無菌研缽中，然后逐滴加入稀釋混合人血清，邊加邊研磨，直至滴一滴至水中不散開為止，此即完全乳化的油包水狀態(tài)。2)注射器法：即用兩個注射器對接，使佐劑與抗原往返推拉，以至乳化。⑵ 抗原福氏完全佐劑免疫動物：取健康家兔，用剪刀減去家兔雙后足足掌的毛，碘酒和酒精棉球消毒。兩周后，再于腘窩淋巴結(jié)內(nèi)注射抗原福氏完全佐劑， 。⑷ 試血：采血方法同傷寒沙門菌O抗血清制備。如效價不夠，可追加免疫。 獲得的免疫血清需要進(jìn)行特異性檢測、親和力測定和效價滴定?？扇苄钥乖鄳?yīng)抗體的效價和純度多選用環(huán)狀沉淀、瓊脂擴散和免疫電泳的方法檢測。抗血清鑒定的方法詳見后述相應(yīng)實驗。純化的步驟為：50%飽和硫酸銨鹽析以沉淀血清球蛋白，應(yīng)用透析或分子篩法除鹽。5．抗血清的保存 抗體的保存以濃度20～30mg/ml為宜，加入萬分之一的硫柳汞或千分之一的疊氮鈉防腐，并加入等量的中性甘油，分裝小瓶，—20以下保存，數(shù)月至數(shù)年內(nèi)抗體效價無明顯改變。各試驗結(jié)果的觀察和判斷參見響應(yīng)單元。無血液有型成分殘留和無細(xì)菌等微生物污染。應(yīng)用的動物必須健康，且以雄性為佳。2．抗原的準(zhǔn)備 全血清抗愿應(yīng)該選擇3人以上混合血清，以避免個體差異性；血清應(yīng)新鮮，以保持血清中各成分的活性。3．佐劑的準(zhǔn)備與使用 佐劑應(yīng)用于可溶性抗原的免疫，顆粒性抗原的免疫無需佐劑。在使用佐劑抗原時，若難以吸入注射器，則可將連同裝有佐劑的容器置熱水上加熱，并選用較粗的注射針頭。4．免疫程序并非固定不變，一般而言，不與佐劑一同免疫的抗原，免疫間隔時間較短，可每隔2～3天免疫一次。無論有無佐劑，最后一次免疫一周后采取血清。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫；若欲得到高效價的抗血清，則宜采用大劑量抗原長程免疫。脫敏的原則是少量多次注射抗原，例如，在靜脈注入抗原前，先將抗原少量注入腹腔，lh后再作緩慢靜脈注射。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗體稱為凝集素（agglutinin）?！　∧囼灱仁且粋€定性的檢測方法，即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽性或陰性；也是一個半定量的檢測方法，即將標(biāo)本作一系列對倍稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為滴度。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類。 一 直接凝集反應(yīng) 直接凝集（direct agglutination）反應(yīng)是指細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適量電解質(zhì)參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。 （一）玻片凝集試驗【實驗原理】玻片凝集試驗（slide agglutination test