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醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)doc-展示頁(yè)

2024-08-01 18:35本頁(yè)面
  

【正文】 血凝試驗(yàn)(hem agglutination test)是紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的簡(jiǎn)稱。(方法步驟見肥達(dá)試驗(yàn)) 二 間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原(或抗體)先吸附于適當(dāng)大小的與免疫特異性無關(guān)的顆粒性載體的表面,形成人工的免疫微球(或致敏載體),然后與相應(yīng)抗體(或抗原)作用,在適宜的電解質(zhì)存在的條件下,出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象,稱間接凝集反應(yīng)(indirect agglutination)或被動(dòng)凝集反應(yīng)(passive agglutination)。臨床上常用的直接試管凝集試驗(yàn)為肥達(dá)試驗(yàn)(Widal test)和外斐試驗(yàn)(WeilFelix test)。 (二)試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)(tube agglutination test)為半定量試驗(yàn),在微生物學(xué)檢驗(yàn)中常用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合,保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度,通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)(titer),亦稱為滴度。2.在載波片兩端涂布細(xì)菌時(shí),應(yīng)先涂生理鹽水一側(cè),后涂診斷血清一側(cè),以免將血清誤帶入生理鹽水一側(cè)3.試驗(yàn)后的細(xì)菌仍有傳染性,應(yīng)將玻片放入消毒缸內(nèi)4.若作ABO血型鑒定,室溫過低(-10℃以下)可出現(xiàn)冷凝集,造成假陽(yáng)性結(jié)果。如與對(duì)照測(cè)相同不發(fā)生凝集則為陰性。 將玻片輕輕晃動(dòng),室溫下觀察結(jié)果, 【結(jié)果分析】 生理鹽水對(duì)照測(cè)不出現(xiàn)凝集,為均勻混濁的乳狀液。 用接種環(huán)按無菌操作取生理鹽水和已知診斷血清各2環(huán)分別置于左右格內(nèi)。【器材試劑】1.標(biāo)本 任一常見細(xì)菌的平板或斜面培養(yǎng)物;待測(cè)血清2.試劑 與細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的診斷血清(可用生理鹽水作適當(dāng)稀釋,以免發(fā)生前帶現(xiàn)象)、生理鹽水、已知沙門傷寒菌菌體抗原懸液(7108/ml)、傷寒沙門菌O抗血清。此法簡(jiǎn)便、快速,適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型。一般是用1滴已知診斷血清與1滴受檢菌液或細(xì)胞懸液,在玻片上混勻后,短時(shí)間內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。通過以下實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐,掌握各種凝集反應(yīng)的原理,熟悉方法步驟、結(jié)果判斷以及注意事項(xiàng)。由于凝集反應(yīng)方法簡(jiǎn)便,敏感度高,因而在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。反應(yīng)過程可分為兩階段:①抗原抗體的特異結(jié)合;②出現(xiàn)可見的顆粒凝集。 實(shí)驗(yàn)二 凝集反應(yīng) 細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原,當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后,在適量電解質(zhì)存在的條件下,可逐漸聚集,出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。由于免疫期限及間隔時(shí)間較長(zhǎng),要注意脫敏,尤其在進(jìn)行靜脈免疫時(shí)。加強(qiáng)免疫的劑量一般為首次劑量的1/5~2/5。由于佐劑具有緩釋作用,于佐劑一起免疫的抗原可隔1~2周。注射完畢后,剩余佐劑抗原置4保存。佐劑與抗原混合研磨時(shí),應(yīng)充分乳化,否則難以達(dá)到預(yù)期的免疫效果。在細(xì)菌性抗原制備過程中,應(yīng)嚴(yán)格無菌操作,保證其純度和避免對(duì)實(shí)驗(yàn)者的感染。為了避免個(gè)體差異,每種抗原最好免疫3只以上動(dòng)物?!咀⒁馐马?xiàng)】動(dòng)物的選擇 免疫血清的制備多選用家兔為免疫對(duì)象,若系大量制備或二抗種屬特異性的需要,也可選用羊或馬。此外,抗血清的外觀應(yīng)該為澄清,力求無溶血?!窘Y(jié)果分析】抗原免疫動(dòng)物后獲得的抗血清,效價(jià)可用上述相應(yīng)試驗(yàn)判斷;其特異性則可通過雙擴(kuò),免疫電泳或交叉凝集試驗(yàn)進(jìn)行考察。除鹽后的球蛋白過陰離子交換柱(DEAE纖維素),根據(jù)不同類別免疫球蛋白的等電點(diǎn),選用不同pH和離子強(qiáng)度的緩沖液分別洗脫之;高滲或風(fēng)于法濃縮免疫球蛋白,若使用冷凍干燥器則可獲得干燥制品。4.抗血清的純化 更加精細(xì)的免疫試驗(yàn)需要從抗血清中提取免疫球蛋白,此過程稱為抗血清的純化。酶免疫測(cè)定、放射免疫分析及平衡透析等方法,可用于抗體的特異性和親和力測(cè)定。針對(duì)顆粒性抗原的免疫血清效價(jià),可通過凝集或溶細(xì)胞試驗(yàn)(如溶血素效價(jià)滴定)檢測(cè)。⑸ 抗血清采集:頸動(dòng)脈放血或心臟采血獲得的兔血,置37℃促進(jìn)血塊收縮,并用毛細(xì)吸管吸取血清,經(jīng)3000r /min離心去除殘留的紅細(xì)胞。試血時(shí),環(huán)狀沉淀測(cè)定的抗體效價(jià)達(dá)到1:5000,雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)達(dá)到1:16以上即可放血收集血清。⑶ 無佐劑的人血清加強(qiáng)免疫:上述免疫一周后,耳靜脈注射人血清(1:2稀釋) 左右以加強(qiáng)免疫,如此重復(fù)1~2次,并于最后一次注射一周后采血。 ,每只家兔注射量1ml。另外,也可將佐劑置磁力攪拌器上,邊攪拌,邊滴加抗原并繼續(xù)攪拌,使其完全乳化。若系不完全佐劑,則像加入人全血清那樣,按2~20mg/ml的量加入卡介苗。將稀釋血清按與完全佐劑1:1體積的比例混合,制成油包水狀態(tài)。⑷ 放血:勁動(dòng)脈放血(也可心臟采血),以最大限度的獲得血清。⑵ 傷寒沙門菌O 抗原免疫方案:用于免疫動(dòng)物的菌液濃度視菌種的不同而異,傷寒沙門菌、志賀痢疾菌等腸道桿菌,免疫濃度多為109個(gè)/ml左右。將濾過的菌液接種少量于瓊脂平板進(jìn)行無菌試驗(yàn)(37℃,24h),確定無菌后用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至109個(gè)/ml,此為細(xì)菌O抗原,置4℃保存?zhèn)溆?。、鑷子、注射器、研缽、試管等器材和冰箱、離心機(jī)等儀器 。②福氏完全佐劑:于不完全佐劑中加入卡介苗2~20mg/ml,研缽中研磨乳化后即為完全佐劑,冰箱保存?zhèn)溆谩? 【器材試劑】 細(xì)菌菌種(傷寒沙門菌O901)、混合人全血清、健康家兔?!緦?shí)驗(yàn)原理】 用抗原刺激機(jī)體可以使機(jī)體產(chǎn)生抗體,抗原與抗體是一對(duì)概念,抗原的純度和活性,影響著其免疫動(dòng)物后獲得的抗體的特異性和滴度。抗體制備的方案視抗原的性質(zhì)不同而異。 抗體的制備大致包括三個(gè)階段,即抗原的制備與純化、動(dòng)物免疫和血清分離純化與鑒定。在傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法中,尤其是作細(xì)菌的血清學(xué)鑒定時(shí),抗血清即能滿足要求,無需純化,因?yàn)榧兓倪^程將造成免疫球蛋白的丟失??芍苯討?yīng)用于病原的診斷或感染性疾病的緊急預(yù)防和治療;也可通過純化血清中的免疫球蛋白來制作多種與免疫相關(guān)或不相關(guān)疾病的診斷和治療制劑。12.認(rèn)真填寫實(shí)驗(yàn)記錄,按時(shí)提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。服從衛(wèi)生值日安排,認(rèn)真負(fù)責(zé)地做好清潔衛(wèi)生。10.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,應(yīng)清理實(shí)驗(yàn)用品,物歸原處。8.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止吸煙、進(jìn)食、飲水、用嘴習(xí)習(xí)管及濕潤(rùn)標(biāo)簽,不準(zhǔn)隨地吐痰。如將儀器、器材損壞,應(yīng)及時(shí)報(bào)告教師,并登記備案。5.實(shí)驗(yàn)所用的儀器、器材和試劑須按照要求擺放,嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行操作,保證實(shí)驗(yàn)過程順利進(jìn)行,并取得預(yù)期結(jié)果。3.仔細(xì)、耐心地觀察實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的各種現(xiàn)象,及時(shí)、真實(shí)客觀地記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并積極思考,認(rèn)真分析,得出結(jié)論。2.注意保持科學(xué)實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)肅性、嚴(yán)格性和嚴(yán)密性。目的在于激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新性思維,培養(yǎng)學(xué)生的科研能力,提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。通過綜合性實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步訓(xùn)練學(xué)生對(duì)所學(xué)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合運(yùn)用能力、獨(dú)立工作能力和對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析能力。1.基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn) 要求學(xué)生系統(tǒng)學(xué)習(xí)和掌握常用的經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),使學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識(shí),掌握相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技能。實(shí)驗(yàn)教學(xué)作為免疫學(xué)教學(xué)的重要環(huán)節(jié),直接影響大人才的培養(yǎng)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn),特別是在培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、實(shí)踐技能、創(chuàng)新能力方面,具有重要的地位。它與分子生物學(xué)一樣是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床工作不可缺的工具。目前免疫學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概 述免疫學(xué)是一門既古老又嶄新的學(xué)科,涉及醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域,并與理工農(nóng)各學(xué)科相互滲透。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是生命科學(xué)的前沿學(xué)科,也是醫(yī)學(xué)生的主干必修課程之一。現(xiàn)代免疫學(xué)的研究和應(yīng)用涉及到生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是一門實(shí)踐性、應(yīng)用性很強(qiáng)的學(xué)科,教學(xué)過程分為理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)。一醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的開設(shè),目的在于不僅使學(xué)生驗(yàn)證部分理論知識(shí)和加深對(duì)課堂講授內(nèi)容的理解,更重要的是在掌握系統(tǒng)理論知識(shí)的基礎(chǔ)上,學(xué)習(xí)和掌握免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)和技能,培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析和解決問題的能力,以及嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度和創(chuàng)新精神,提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。2.綜合性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及本課程的綜合知識(shí)或相關(guān)課程知識(shí)的實(shí)驗(yàn),往往由多種實(shí)驗(yàn)手段、技術(shù)和層次的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容所組成。3.設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) 是在完成基礎(chǔ)性試驗(yàn)和綜合性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,給定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求和所提供的?shí)驗(yàn)條件,由學(xué)生自行查閱資料,自選題目、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,并在老師指導(dǎo)下,進(jìn)行試驗(yàn),最后以論文形式寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。二醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1.學(xué)生在上實(shí)驗(yàn)課前,應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行預(yù)習(xí),明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求,了解?shí)驗(yàn)原理和操作步驟,熟悉所要使用的儀器、藥品的性質(zhì)和注意事項(xiàng),預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中,應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真地觀察教師的演示,嚴(yán)肅認(rèn)真地按規(guī)定步驟進(jìn)行操作。4.積極參與小組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),樹立團(tuán)隊(duì)精神,并發(fā)揮自己的聰明才智,創(chuàng)造性地開展科學(xué)實(shí)驗(yàn)。6.要愛護(hù)公共財(cái)物,節(jié)約試劑材料,不得將實(shí)驗(yàn)室任何物品私自帶走。7.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持安靜,遵守紀(jì)律,不得高聲談笑、隨便走動(dòng)、玩弄?jiǎng)游铩?.如有傳染性材料、有毒材料流灑與桌面、地面或衣服上,或發(fā)現(xiàn)割破皮膚、被動(dòng)物咬傷等意外時(shí),要及時(shí)報(bào)告教師,做好妥善處理。實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)放入或倒入指定的地方或容器內(nèi)。11.離開實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)洗手,注意關(guān)好水、電、門、窗等。第一章基礎(chǔ)性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 免疫血清的制備免疫血清是機(jī)體受到抗原物質(zhì)刺激后的血清,含有特異性免疫球蛋白。免疫血清又稱抗血清或抗體,而從抗血清中純化的免疫球蛋白則只能稱為抗體。但在現(xiàn)代免疫學(xué)方法中,由于免疫標(biāo)記和反應(yīng)精確度的需要,必須純化抗血清的有效成分,即獲得免疫球蛋白甚至是某一類或亞類的免疫球蛋白??乖侵苽淇贵w的先決條件,要制備高質(zhì)量的抗體,必須首先獲得特異性高的抗原性物質(zhì)?!灸康囊蟆勘緦?shí)驗(yàn)制備抗人全血清和傷寒沙門菌O抗體,要求掌握免疫血清制備的原理及其方法步驟。根據(jù)抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律,視抗原的性質(zhì)選擇不同的途徑免疫動(dòng)物,經(jīng)初次、再次免疫的過程,使得動(dòng)物血清中產(chǎn)生足量的特異性抗體,繼而分離血清并純化免疫球蛋白,得到免疫血清或抗體。 ①福氏不完全佐劑:稱取羊毛脂5g,逐滴加入石蠟油20ml(羊毛脂:石蠟油可為1:1~1:4),高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。、麥?zhǔn)媳葷峁?、甘油、防腐劑(%%硫柳汞)等?!痉椒ú襟E】 抗體的制備⑴ 傷寒沙門菌O 抗原的制備:經(jīng)革蘭染色作細(xì)菌純度鑒定的傷寒沙門菌O901,密集劃線接種于普通瓊脂平板(若需大量制備,可接種于用柯氏瓶制備的瓊脂培養(yǎng)基),37℃培養(yǎng)24~48h后,用生理鹽水將細(xì)菌菌苔洗于清潔、無菌的三角燒瓶中,置60℃水浴或隔水煮沸1h以破壞細(xì)菌的鞭毛,用濾紙過濾(大量制備時(shí))或移入離心管4000r/min離心10~20min(少量時(shí))。若制備鞭毛抗原,則可用含有5%石炭酸(苯酚)的生理鹽水洗下瓊脂平板上的菌苔,37℃溫育48h后作無菌試驗(yàn),濾過后用生理鹽水配成一定濃度。細(xì)菌性抗原的免疫方案大致相同,見表1—1 表1-1 傷寒沙門菌O抗原的免疫方案免疫日期(天)免疫途徑抗原免疫劑量(ml)1多點(diǎn)皮內(nèi)傷寒沙門O抗原6靜脈傷寒沙門O抗原11靜脈傷寒沙門O抗原16靜脈傷寒沙門O抗原19靜脈傷寒沙門O抗原 ⑶ 試血:末次免疫7d后即可試血,耳靜脈或心臟采血,分離血清與傷寒沙門菌O抗原作試管凝集試驗(yàn),凝集效價(jià)(滴度)在1:1600~3200之間時(shí)即可放血,若效價(jià)較低可繼續(xù)加強(qiáng)免疫。⑴ 抗原福氏完全佐劑:取混合人全血清,用生理鹽水作1:4稀釋。具體方法如下:1)研磨法:取完全佐劑置于無菌研缽中,然后逐滴加入稀釋混合人血清,邊加邊研磨,直至滴一滴至水中不散開為止,此即完全乳化的油包水狀態(tài)。2)注射器法:即用兩個(gè)注射器對(duì)接,使佐劑與抗原往返推拉,以至乳化。⑵ 抗原福氏完全佐劑免疫動(dòng)物:取健康家兔,用剪刀減去家兔雙后足足掌的毛,碘酒和酒精棉球消毒。兩周后,再于腘窩淋巴結(jié)內(nèi)注射抗原福氏完全佐劑, 。⑷ 試血:采血方法同傷寒沙門菌O抗血清制備。如效價(jià)不夠,可追加免疫。 獲得的免疫血清需要進(jìn)行特異性檢測(cè)、親和力測(cè)定和效價(jià)滴定??扇苄钥乖鄳?yīng)抗體的效價(jià)和純度多選用環(huán)狀沉淀、瓊脂擴(kuò)散和免疫電泳的方法檢測(cè)。抗血清鑒定的方法詳見后述相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。純化的步驟為:50%飽和硫酸銨鹽析以沉淀血清球蛋白,應(yīng)用透析或分子篩法除鹽。5.抗血清的保存 抗體的保存以濃度20~30mg/ml為宜,加入萬(wàn)分之一的硫柳汞或千分之一的疊氮鈉防腐,并加入等量的中性甘油,分裝小瓶,—20以下保存,數(shù)月至數(shù)年內(nèi)抗體效價(jià)無明顯改變。各試驗(yàn)結(jié)果的觀察和判斷參見響應(yīng)單元。無血液有型成分殘留和無細(xì)菌等微生物污染。應(yīng)用的動(dòng)物必須健康,且以雄性為佳。2.抗原的準(zhǔn)備 全血清抗愿應(yīng)該選擇3人以上混合血清,以避免個(gè)體差異性;血清應(yīng)新鮮,以保持血清中各成分的活性。3.佐劑的準(zhǔn)備與使用 佐劑應(yīng)用于可溶性抗原的免疫,顆粒性抗原的免疫無需佐劑。在使用佐劑抗原時(shí),若難以吸入注射器,則可將連同裝有佐劑的容器置熱水上加熱,并選用較粗的注射針頭。4.免疫程序并非固定不變,一般而言,不與佐劑一同免疫的抗原,免疫間隔時(shí)間較短,可每隔2~3天免疫一次。無論有無佐劑,最后一次免疫一周后采取血清。如需制備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫;若欲得到高效價(jià)的抗血清,則宜采用大劑量抗原長(zhǎng)程免疫。脫敏的原則是少量多次注射抗原,例如,在靜脈注入抗原前,先將抗原少量注入腹腔,lh后再作緩慢靜脈注射。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原(agglutinogen),抗體稱為凝集素(agglutinin)?! ∧囼?yàn)既是一個(gè)定性的檢測(cè)方法,即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽(yáng)性或陰性;也是一個(gè)半定量的檢測(cè)方法,即將標(biāo)本作一系列對(duì)倍稀釋后進(jìn)行反應(yīng),以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為滴度。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類。 一 直接凝集反應(yīng) 直接凝集(direct agglutination)反應(yīng)是指細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原,在適量電解質(zhì)參與下,直接與相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。 (一)玻片凝集試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】玻片凝集試驗(yàn)(slide agglutination test
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