【正文】 每個(gè)火箭可出現(xiàn)多個(gè)子峰；抗原與抗體比例不適合或電泳條件不適當(dāng)時(shí)不出現(xiàn)火箭峰。 2．應(yīng)選擇電滲作用最小的精制瓊脂粉或優(yōu)質(zhì)瓊脂糖來制備凝膠，而不用普通瓊脂。使用低電壓、低離子強(qiáng)度、電泳時(shí)間長些，效果會(huì)更好?！緦?shí)驗(yàn)原理】免疫電泳(immunoeletrophoresis，IEP)是瓊脂區(qū)帶電泳和凝膠雙擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。 【器材試劑】 1．標(biāo)本 正常人血清、待鑒定的人IgG提取液。凝固后按孔型樣板打孔、開槽。為便于觀察樣品泳動(dòng)位置可在正常人血清中加微量氨基黑染液。用毛細(xì)滴管加入抗人全血清，充滿槽內(nèi)，勿使外溢。待鑒定的提純?nèi)薎gG的沉淀弧應(yīng)主要在γ區(qū)，并可延伸到β區(qū)，甚至α區(qū)。 3，如欲制作染色標(biāo)本，可將瓊脂板浸泡于生理鹽水中24～48h，其間換水2～3次，以除去未反應(yīng)的蛋白，再用蒸餾水浸泡2h除鹽，然后于板上覆蓋用水浸濕的棉布一塊，置于37℃溫箱過夜，使其干燥，再浸入氨基黑染液中染10～20min，用脫色液脫色，保存。臨床上常用于骨髓瘤、γ球蛋白缺乏癥、肝臟疾病、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者血清蛋白成分的分析。 3．為防止電泳后兩個(gè)緩沖槽中緩沖液的pH與離子強(qiáng)度有所改變，每次電泳后應(yīng)更換陰陽電極，或?qū)刹壑械木彌_液混合。因此可通過測(cè)定透射光衰減(以A值表示)或散射光強(qiáng)度來檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)，本試驗(yàn)以常用透射比濁法檢測(cè)人血清IgG為例。12H2O 、NaH2PO4取上述IgG標(biāo)準(zhǔn)液各10μl，分放于4個(gè)試管中；另取生理鹽水10μl，放于第5支試管中，作為空白對(duì)照。 4．抗原抗體反應(yīng) 向各標(biāo)準(zhǔn)管和血清管中分別加入稀釋抗血清，混勻后至37℃水浴 30min。各血清管的IgG含量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得。 4．本方法敏感度高于瓊脂單擴(kuò)散試驗(yàn)5～10倍，批內(nèi)、批間重復(fù)性較好，操作簡(jiǎn)便快速，1h可出結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)四 補(bǔ)體參與的反應(yīng) 通過以下補(bǔ)體參與的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的操作，要掌握各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的基本原理，熟悉操作步驟、結(jié)果判斷及注意事項(xiàng)；還要進(jìn)一步增加對(duì)補(bǔ)體生物活性的感性認(rèn)識(shí)， 一 血清總補(bǔ)體溶血活性（CH50）測(cè)定 【實(shí)驗(yàn)原理】溶血素（抗綿羊紅細(xì)胞抗體）與綿羊紅細(xì)胞接觸后發(fā)生特異性結(jié)合，此時(shí)可激活補(bǔ)體（經(jīng)典途徑），從而使綿羊紅細(xì)胞溶解。使用時(shí)用蒸餾水1:5稀釋。溶血素（抗SRBC抗體） 按效價(jià)用BB液稀釋至2單位。制備50％溶血標(biāo)準(zhǔn)管 取2％SRBC懸液2ml加蒸餾水8ml，SRBC全部溶解，為100％全溶管。用721分光光度計(jì)在波長542nm讀T值。在急性炎癥、感染、組織損傷（如風(fēng)濕熱急性期、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎、皮肌炎、傷寒、Reiter綜合征和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎）、腫瘤、骨髓瘤等時(shí)，?？梢娧a(bǔ)體含量升高，使CH50值偏高；低補(bǔ)體血癥多見于與免疫有關(guān)的疾病，系病程中免疫應(yīng)答消耗了補(bǔ)體所致，如：急性腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)期、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。試驗(yàn)中吸取2％SRBC時(shí)注意不斷輕搖。紅細(xì)胞濃度增加一倍，可使50％溶血補(bǔ)體量增加25％左右。 二 溶血試驗(yàn) 【實(shí)驗(yàn)原理】動(dòng)物接受異種細(xì)胞注射而免疫，于血清中產(chǎn)生特異性抗體（即溶血素），此紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，在電解質(zhì)存在時(shí)能發(fā)生凝集，若再有補(bǔ)體參與，紅細(xì)胞則被溶解，稱溶血反應(yīng)（hemolytic）。補(bǔ)體（2個(gè)實(shí)用單位）。不溶血：呈紅細(xì)胞混懸液。所以檢測(cè)補(bǔ)體活性的血清標(biāo)本和作為補(bǔ)體試劑的血清必須新鮮。 三 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 【實(shí)驗(yàn)原理】 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（plement fixation test）是一種有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。本反應(yīng)敏感性、特異性均較高，可用于檢測(cè)某些病毒病、立克次體病、梅毒病等。圖4－1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)示意圖【器材試劑】 1．抗原 用傷寒桿菌可溶性抗原、2%綿羊細(xì)胞懸液。然后判斷待檢血清是否為陽性反應(yīng)。 3．補(bǔ)體性質(zhì)不穩(wěn)定，以試驗(yàn)的當(dāng)天采取效果最好，操作時(shí)盡量減少在室溫停留的時(shí)間。通過顯微鏡計(jì)數(shù)死細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率，判斷細(xì)胞死亡率?！酒鞑脑噭?．動(dòng)物 46周齡的健康小鼠。5．含5%新生牛血清的冷Hanks液、%戊二醛。（2）用解剖器械打開胸腔，取出胸腺，置含有4ml冷Hanks液的平皿內(nèi)。通常，1081108個(gè)細(xì)胞。（3）% ml，混勻，立即滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，迅速鏡檢（要求在5min內(nèi)鏡檢完畢）。2．因有的豚鼠血清對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞有天然毒性作用，故應(yīng)篩選活性高、毒性低的新鮮豚鼠血清作為補(bǔ)體，對(duì)獲滿意結(jié)果至關(guān)重要。附 HLA血清學(xué)分型法人類白細(xì)胞抗原（HLA）是由HLA復(fù)合體編碼的一組抗原，具有高度的多態(tài)性，HLA不論在基礎(chǔ)免疫學(xué)，還是臨床醫(yī)學(xué)方面，均具有重要的研究價(jià)值。若待檢淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原與移植分型血清（抗體）一致，在補(bǔ)體作用下導(dǎo)致細(xì)胞毒作用。死亡細(xì)胞被染料著色。2．HLA分型板市售標(biāo)準(zhǔn)HLA分型反應(yīng)板（Terasaki板），一般為72孔，從上至下分為112行，從左至右分為A、B、C、D、E、F 6列。5．器材 導(dǎo)致相差顯微鏡或普通光學(xué)顯微鏡、水平離心機(jī)、冰箱、微量移液器等。3． 每孔加兔補(bǔ)體5181。5． 每孔加12%中性甲醛溶液8181。表45 微量細(xì)胞毒試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)死細(xì)胞（%） 計(jì)分 結(jié)果判斷死細(xì)胞（%） 計(jì)分 結(jié)果判斷010 1 陰性1120 2 微弱陽性2140 4 弱陽性 4180 6 陽性 81100 8 強(qiáng)陽性【注意事項(xiàng)】1．用于HLA分型的血液標(biāo)本以玻璃珠脫纖維抗凝為好，詞法淋巴細(xì)胞獲得率高，血小板污染少，結(jié)果宜于觀察。補(bǔ)體的采集以20只以上家兔的血清混合為好，小量分裝，200C低溫或凍干保存。它可借助熒光顯微鏡，射線測(cè)量儀，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定，可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的~特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而顯色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。酶免疫技術(shù)是目前主流的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)科的各個(gè)領(lǐng)域。HRP含有18％的碳水化合物，酶的糖鏈部分與酶的活性無關(guān)，用過碘酸鈉將酶表面糖分子的羥基氧化為醛基，醛基的化學(xué)性質(zhì)活潑，可與抗體分子的氨基結(jié)合，形成按克分子比例結(jié)合的酶標(biāo)記物，然后用NaHB4還原即成酶標(biāo)記的抗體。加入待標(biāo)記的抗體5～10mg， ，4℃過夜。（參見酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）【注意事項(xiàng)】該法可獲得高產(chǎn)量具有高度免疫活性和非特異性顯色低的標(biāo)記物。當(dāng)加入陽性標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）后即與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)而結(jié)合到固相載體上。試劑（1）包被緩沖液（、）； （2）洗滌緩沖液（ PBS）；（3）稀釋液【％牛血清白蛋白（BSA）或使用以羊血清、兔血清等與洗滌液配成的5%—10%液】； （4）終止液（2 M H2SO4）； （5）底物緩沖液（pH ）；（6）TBM（四甲基聯(lián)苯胺）使用液；（7）ABTS顯色液；【注：ABTS,2,2’Azinobis(3ethylbenztbiozoline6sulfonic acid),即2，2’連氮基雙（3乙基苯并噻吡咯啉6磺酸）】?！痉椒ú襟E】1．用于檢測(cè)未知抗原的雙體夾心法：圖5－1 雙體夾心法原理示意圖 （1）包被：用pH 、（包被緩沖液）將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1mg/L～10mg/L。（2）加樣：，置37℃孵育1h。37℃～1h，洗滌。依據(jù)所呈顏色的深淺，以“＋”、“－”號(hào)表示。（2）加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體），置37℃孵育1h，洗滌。【結(jié)果分析】1．肉眼判定 明顯顯色者判為陽性，否則判為陰性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作。（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定，然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度），在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。吸附溫度、時(shí)間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24h。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。本實(shí)驗(yàn)底物為TMB，最大吸收波長為450nm，因此，應(yīng)測(cè)定OD450值。（3）在反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體），37℃孵育30～60imn，洗滌，最后一遍用洗滌液或蒸餾水洗滌。2．用于檢測(cè)未知抗體的間接法：圖5－2 間接法原理示意圖 （1）用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1mg/L～1０mg／Ｌ，4℃過夜。（5）終止反應(yīng)：。同時(shí)做空白孔、陰性對(duì)照孔、陽性對(duì)照孔。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。（2）小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。由于酶的催化頻率很高，可放大反應(yīng)的效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。如果需要可進(jìn)一步對(duì)酶標(biāo)抗體純化，以去除未結(jié)合的抗體。加適量中性甘油后小量分裝，置－20℃～－30℃保存?！痉椒ú襟E】（改良過碘酸鹽氧化法）將HRP HAC－NaAC緩沖液中，滴入NaIO4 （此時(shí)酶的顏色應(yīng)由黃變綠），4℃作用30min。 （一）酶標(biāo)抗體的制備【基本原理】 通過化學(xué)反應(yīng)或免疫反應(yīng)，使酶與抗體結(jié)合，其結(jié)合的產(chǎn)物為酶標(biāo)抗體。顯色反應(yīng)顯示了酶的存在，從而證明了相應(yīng)免疫反應(yīng)的發(fā)生。熒光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)和放射免疫技術(shù)，即經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)。它的特點(diǎn)是具有高度的特異性和敏感性。3．使用的補(bǔ)體應(yīng)新鮮，活性高。6． 靜置，待細(xì)胞下沉后用低倍鏡倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果。4． 每孔加5%伊紅Y水溶液3181。2． 每孔加2106/ml PBMC懸液1181。3．補(bǔ)體 采用家兔新鮮混合血清。【器材試劑】 1．待檢淋巴細(xì)胞懸液 取待檢者抗凝血10ml，采用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，洗滌后用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2106/ml。應(yīng)用血清學(xué)方法鑒定的抗原稱為SD抗原，包括HLAA、B、C、DR和DQ抗原。HLA分型的方法，主要有血清學(xué)分型法、細(xì)胞學(xué)分型法和基因分型法等技術(shù)。4．實(shí)驗(yàn)用品要潔凈，試劑配制要準(zhǔn)確，避免各種可能的干擾因素影響試驗(yàn)結(jié)果。死細(xì)胞腫脹變大，呈暗紅色；活細(xì)胞形態(tài)正常，不著色，折光性強(qiáng)，有立體感。輕輕混勻后，置370C水浴30min。（3）將上述細(xì)胞懸液移如試管，1 000 r/min，離心10 min 。7．試管、吸管、載玻片等。3．補(bǔ)體 豚鼠新鮮血清，經(jīng)小鼠胸腺細(xì)胞吸收后，用5%新生牛血清的冷Hanks液作1：3稀釋。如在進(jìn)行同種異體移植時(shí)，通過檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原或血清中抗HLA抗體，可用于HLA定型和HLA配型；也可用于已知抗T淋巴細(xì)胞血清，鑒定T細(xì)胞亞群；還可用于人的淋巴細(xì)胞作抗原，檢測(cè)抗淋巴細(xì)胞自身抗體?！净驹怼繋в斜砻婵乖陌屑?xì)胞與其相應(yīng)特異性抗體結(jié)合后，在補(bǔ)體存在的情況下，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，導(dǎo)致靶細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而細(xì)胞裂解死亡，為補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)。【注意事項(xiàng)】1．以細(xì)菌作抗原時(shí)，應(yīng)使用細(xì)菌的提取液而不用懸液，通過滴定找出最適稀釋度。3．其他 補(bǔ)體（2個(gè)實(shí)用單位）、生理鹽水、小試管、吸管、37℃水浴箱。因此作本試驗(yàn)之前必須通過一系列預(yù)備試驗(yàn)來確定補(bǔ)體、溶血素、抗原或抗體的使用量。反之若出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，則為補(bǔ)體結(jié)合陰性，表示待檢的抗原抗體不對(duì)應(yīng)或缺少一方，不能固定補(bǔ)體，游離補(bǔ)體被后加入的指示系統(tǒng)固定，導(dǎo)致綿羊紅細(xì)胞溶解。一般沒有必要進(jìn)一步提純抗體，但在試驗(yàn)前需先經(jīng)過56℃30min或60℃3min以滅活補(bǔ)體。必須保存時(shí)采用小量分裝的辦法，置－70℃下可保存數(shù)月，避免反復(fù)凍融?！痉椒ú襟E】取小試管4支，分別注明管號(hào)，按下表依次將各成分加入試管中?！酒鞑脑噭?%綿羊紅細(xì)胞懸液（SRBC）。鈣、鎂離子的存在可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但含量過多時(shí)，反而抑制溶血反應(yīng)。補(bǔ)體的溶血活性受多種因素的影響，如綿羊紅細(xì)胞濃度及溶血素的量等。實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)清潔。第10管為空白對(duì)照管，實(shí)驗(yàn)正常，應(yīng)不發(fā)生溶血。管號(hào) 1：20 血清mlBB液溶血ml（2U/ml）2%綿羊紅細(xì)胞ml 搖勻置37℃水浴箱內(nèi)30min，取出離心2500rpm5min觀察結(jié)果對(duì)應(yīng)管50％溶血所示血清總補(bǔ)體活性（U/ml）120021333100480566．6657．1750844．494010－－取試管10支，分別編號(hào)到10，按表4－1加入物質(zhì)。試管、空針、針頭、刻度吸管、離心機(jī)、721分光光度計(jì)（）、水浴箱等。比積SRBC用BB液配成2％細(xì)胞懸液。在50％溶血（CH50）時(shí)，其溶血的程度與補(bǔ)體量的關(guān)系最敏感，近似直線關(guān)系，故以50％溶血度作為反應(yīng)的終點(diǎn)指標(biāo)，所測(cè)補(bǔ)體量較為準(zhǔn)確，由于綿羊紅細(xì)胞與溶血素結(jié)合激活補(bǔ)體是經(jīng)典C1途徑，所以此反應(yīng)