【正文】 過多時，反而抑制溶血反應(yīng)?！痉椒ú襟E】取小試管4支，分別注明管號，按下表依次將各成分加入試管中。一般沒有必要進一步提純抗體，但在試驗前需先經(jīng)過56℃30min或60℃3min以滅活補體。因此作本試驗之前必須通過一系列預(yù)備試驗來確定補體、溶血素、抗原或抗體的使用量。【注意事項】1．以細菌作抗原時，應(yīng)使用細菌的提取液而不用懸液，通過滴定找出最適稀釋度。如在進行同種異體移植時，通過檢測淋巴細胞表面的HLA抗原或血清中抗HLA抗體，可用于HLA定型和HLA配型；也可用于已知抗T淋巴細胞血清，鑒定T細胞亞群；還可用于人的淋巴細胞作抗原，檢測抗淋巴細胞自身抗體。7．試管、吸管、載玻片等。輕輕混勻后，置370C水浴30min。4．實驗用品要潔凈，試劑配制要準確，避免各種可能的干擾因素影響試驗結(jié)果。應(yīng)用血清學(xué)方法鑒定的抗原稱為SD抗原，包括HLAA、B、C、DR和DQ抗原。3．補體 采用家兔新鮮混合血清。4． 每孔加5%伊紅Y水溶液3181。3．使用的補體應(yīng)新鮮，活性高。熒光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)和放射免疫技術(shù)，即經(jīng)典的三大標記技術(shù)。 （一）酶標抗體的制備【基本原理】 通過化學(xué)反應(yīng)或免疫反應(yīng)，使酶與抗體結(jié)合，其結(jié)合的產(chǎn)物為酶標抗體。加適量中性甘油后小量分裝，置－20℃～－30℃保存。由于酶的催化頻率很高，可放大反應(yīng)的效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。（5）終止反應(yīng)：。（3）在反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體），37℃孵育30～60imn，洗滌，最后一遍用洗滌液或蒸餾水洗滌。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。（3）酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定，然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度），在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。（2）加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體），置37℃孵育1h，洗滌。37℃～1h，洗滌?！痉椒ú襟E】1．用于檢測未知抗原的雙體夾心法：圖5－1 雙體夾心法原理示意圖 （1）包被：用pH 、（包被緩沖液）將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1mg/L～10mg/L。當(dāng)加入陽性標本（測定其中的抗體或抗原）后即與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)而結(jié)合到固相載體上。加入待標記的抗體5～10mg， ，4℃過夜。酶免疫技術(shù)是目前主流的免疫學(xué)檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)科的各個領(lǐng)域。它可借助熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定，可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定。表45 微量細胞毒試驗的判定標準死細胞（%） 計分 結(jié)果判斷死細胞（%） 計分 結(jié)果判斷010 1 陰性1120 2 微弱陽性2140 4 弱陽性 4180 6 陽性 81100 8 強陽性【注意事項】1．用于HLA分型的血液標本以玻璃珠脫纖維抗凝為好，詞法淋巴細胞獲得率高，血小板污染少，結(jié)果宜于觀察。3． 每孔加兔補體5181。2．HLA分型板市售標準HLA分型反應(yīng)板（Terasaki板），一般為72孔，從上至下分為112行，從左至右分為A、B、C、D、E、F 6列。若待檢淋巴細胞表面的HLA抗原與移植分型血清（抗體）一致，在補體作用下導(dǎo)致細胞毒作用。2．因有的豚鼠血清對小鼠淋巴細胞有天然毒性作用，故應(yīng)篩選活性高、毒性低的新鮮豚鼠血清作為補體，對獲滿意結(jié)果至關(guān)重要。通常，1081108個細胞。5．含5%新生牛血清的冷Hanks液、%戊二醛。通過顯微鏡計數(shù)死細胞占總細胞數(shù)的比率，判斷細胞死亡率。然后判斷待檢血清是否為陽性反應(yīng)。本反應(yīng)敏感性、特異性均較高，可用于檢測某些病毒病、立克次體病、梅毒病等。所以檢測補體活性的血清標本和作為補體試劑的血清必須新鮮。補體（2個實用單位）。紅細胞濃度增加一倍，可使50％溶血補體量增加25％左右。在急性炎癥、感染、組織損傷（如風(fēng)濕熱急性期、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、皮肌炎、傷寒、Reiter綜合征和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎）、腫瘤、骨髓瘤等時，?？梢娧a體含量升高，使CH50值偏高；低補體血癥多見于與免疫有關(guān)的疾病，系病程中免疫應(yīng)答消耗了補體所致，如：急性腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。制備50％溶血標準管 取2％SRBC懸液2ml加蒸餾水8ml，SRBC全部溶解，為100％全溶管。使用時用蒸餾水1:5稀釋。 4．本方法敏感度高于瓊脂單擴散試驗5～10倍，批內(nèi)、批間重復(fù)性較好，操作簡便快速，1h可出結(jié)果。 4．抗原抗體反應(yīng) 向各標準管和血清管中分別加入稀釋抗血清，混勻后至37℃水浴 30min。12H2O 、NaH2PO4 3．為防止電泳后兩個緩沖槽中緩沖液的pH與離子強度有所改變，每次電泳后應(yīng)更換陰陽電極，或?qū)刹壑械木彌_液混合。 3，如欲制作染色標本，可將瓊脂板浸泡于生理鹽水中24～48h，其間換水2～3次，以除去未反應(yīng)的蛋白，再用蒸餾水浸泡2h除鹽，然后于板上覆蓋用水浸濕的棉布一塊，置于37℃溫箱過夜，使其干燥，再浸入氨基黑染液中染10～20min，用脫色液脫色，保存。用毛細滴管加入抗人全血清，充滿槽內(nèi)，勿使外溢。凝固后按孔型樣板打孔、開槽?！緦嶒炘怼棵庖唠娪?immunoeletrophoresis，IEP)是瓊脂區(qū)帶電泳和凝膠雙擴散相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。 2．應(yīng)選擇電滲作用最小的精制瓊脂粉或優(yōu)質(zhì)瓊脂糖來制備凝膠，而不用普通瓊脂。待測樣品的定量可根據(jù)峰高從標準曲線上查出。另外，向另一板的孔中加入系列已知濃度的陽性血清或其他抗原，用來繪制標準曲線。 【器材試劑】 1．標本 待檢人血清、陽性血清(臍帶血清)。5．電泳完畢，先斷電源（不僅關(guān)閉電源按鈕，一定要脫開電泳槽和電泳儀之間的連接線，以防積蓄電壓觸電），再取出電泳板。3．對流免疫電泳實際上是電場作用下的瓊脂雙擴散試驗，操作簡便，觀察結(jié)果快，敏感度比瓊脂雙擴散法高8~16倍?！痉椒ú襟E】1．制板 。3．瓊脂熔化后置水浴中保溫時，溫度不可超過56℃，否則會使抗體變性；溫度也不可過低，否則瓊脂易凝固而不能澆制出很好的瓊脂板。6．繪制標準曲線 以各稀釋度工作標準的沉淀環(huán)直徑為橫坐標，相應(yīng)孔中IgG含量為縱坐標，在半數(shù)紙上繪制標準曲線。2．澆板 ，注意澆板要均勻、平整、無氣泡、布滿整張載玻片?！緦嶒炘怼? 將一定量抗體混勻于瓊脂凝膠內(nèi)，凝膠孔中加入抗原，抗原向四周擴散的過程中與凝膠中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在抗原與抗體比例合適處形成抗原抗體復(fù)合物，呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)。4．此方法簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠；但靈敏度低，試驗所需時間長，且只能定性，不能定量，僅適用于大量普查項目。4．?dāng)U散 將加好樣的瓊脂板放入濕盒中（內(nèi)有5mol/L的石炭酸紗布），置室溫或37℃1~2d，于24h和48h各觀察和記錄結(jié)果一次。 2．試劑 羊抗人IgG診斷血清、15g/L鹽水瓊脂等。3．本試驗常用于抗原的定性試驗，如診斷炭疽的Ascoli 試驗、血跡的鑒別等?！窘Y(jié)果分析】 第1格內(nèi)形成白色凝集物，第3格內(nèi)無凝集。再將此懸液加熱56℃30min，迅速冷卻，再以PBS洗3次，%—%NaN3的PBS制成10%懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?（四）金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗【實驗原理】 金黃色葡萄的細胞壁成分中，含有一種稱為A蛋白的抗原物質(zhì)（SPA）能與人及多種哺乳動物IgG的Fc段發(fā)生非特異性結(jié)合，因此可利用金黃色葡萄球菌為載體吸附IgG。4．生理鹽水、黑色方格反應(yīng)板、牙簽、毛細滴管、刻度吸管、試管、水浴箱等等。3．血凝板、稀釋棒用后均需用體積分數(shù)為10%次氯酸鈉浸過夜；滴管需煮佛10min，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。然后，對照排各孔加1:。2．（一般每孔均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔、第8孔為致敏紅細胞對照。根據(jù)紅細胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強弱（圖2－2），以＋＋凝集的孔為滴度終點?！痉椒ú襟E】1． 取小試管10支，排于試管架上。（方法步驟見肥達試驗） 二 間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的與免疫特異性無關(guān)的顆粒性載體的表面，形成人工的免疫微球（或致敏載體），然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination）或被動凝集反應(yīng)（passive agglutination）。如與對照測相同不發(fā)生凝集則為陰性。此法簡便、快速，適用于從病人標本中分離得到的菌種的診斷或分型。由于凝集反應(yīng)方法簡便，敏感度高，因而在臨床檢驗中被廣泛應(yīng)用。加強免疫的劑量一般為首次劑量的1/5～2/5。在細菌性抗原制備過程中，應(yīng)嚴格無菌操作，保證其純度和避免對實驗者的感染?！窘Y(jié)果分析】抗原免疫動物后獲得的抗血清，效價可用上述相應(yīng)試驗判斷；其特異性則可通過雙擴，免疫電泳或交叉凝集試驗進行考察。針對顆粒性抗原的免疫血清效價，可通過凝集或溶細胞試驗（如溶血素效價滴定）檢測。 ,每只家兔注射量1ml。⑷ 放血：勁動脈放血（也可心臟采血），以最大限度的獲得血清。②福氏完全佐劑：于不完全佐劑中加入卡介苗2～20mg/ml，研缽中研磨乳化后即為完全佐劑，冰箱保存?zhèn)溆谩? 抗體的制備大致包括三個階段，即抗原的制備與純化、動物免疫和血清分離純化與鑒定。服從衛(wèi)生值日安排，認真負責(zé)地做好清潔衛(wèi)生。5．實驗所用的儀器、器材和試劑須按照要求擺放，嚴格按照操作程序進行操作，保證實驗過程順利進行，并取得預(yù)期結(jié)果。通過綜合性實驗，進一步訓(xùn)練學(xué)生對所學(xué)知識和實驗技術(shù)的綜合運用能力、獨立工作能力和對實驗結(jié)果的綜合分析能力。目前免疫學(xué)的研究已經(jīng)進入了一個嶄新的時代。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是一門實踐性、應(yīng)用性很強的學(xué)科，教學(xué)過程分為理論教學(xué)和實驗教學(xué)。二醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗室規(guī)則1．學(xué)生在上實驗課前，應(yīng)對實驗內(nèi)容進行預(yù)習(xí)，明確實驗?zāi)康?、要求，了解實驗原理和操作步驟，熟悉所要使用的儀器、藥品的性質(zhì)和注意事項，預(yù)測實驗結(jié)果。7．實驗室內(nèi)應(yīng)保持安靜，遵守紀律，不得高聲談笑、隨便走動、玩弄動物。第一章基礎(chǔ)性試驗 實驗一 免疫血清的制備免疫血清是機體受到抗原物質(zhì)刺激后的血清，含有特異性免疫球蛋白?！灸康囊蟆勘緦嶒炛苽淇谷巳搴蛡抽T菌O抗體,要求掌握免疫血清制備的原理及其方法步驟?！痉椒ú襟E】 抗體的制備⑴ 傷寒沙門菌O 抗原的制備：經(jīng)革蘭染色作細菌純度鑒定的傷寒沙門菌O901，密集劃線接種于普通瓊脂平板（若需大量制備，可接種于用柯氏瓶制備的瓊脂培養(yǎng)基），37℃培養(yǎng)24～48h后，用生理鹽水將細菌菌苔洗于清潔、無菌的三角燒瓶中，置60℃水浴或隔水煮沸1h以破壞細菌的鞭毛，用濾紙過濾（大量制備時）或移入離心管4000r/min離心10～20min（少量時）。具體方法如下：1)研磨法：取完全佐劑置于無菌研缽中，然后逐滴加入稀釋混合人血清，邊加邊研磨，直至滴一滴至水中不散開為止，此即完全乳化的油包水狀態(tài)。⑷ 試血：采血方法同傷寒沙門菌O抗血清制備。抗血清鑒定的方法詳見后述相應(yīng)實驗。無血液有型成分殘留和無細菌等微生物污染。在使用佐劑抗原時，若難以吸入注射器，則可將連同裝有佐劑的容器置熱水上加熱，并選用較粗的注射針頭。脫敏的原則是少量多次注射抗原，例如，在靜脈注入抗原前，先將抗原少量注入腹腔，lh后再作緩慢靜脈注射。 一 直接凝集反應(yīng) 直接凝集（direct agglutination）反應(yīng)是指細菌、紅細胞等顆粒性抗原，在適量電解質(zhì)參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。方法步驟（以鑒定待測標本中的細菌為例） 取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分為左右2格。5．嚴格無菌操作。間接血凝試驗（indirect hem agglutination test）是將可溶性抗原（細菌的提取液等）吸附于紅細胞成為抗原致敏紅細胞，這種“致敏紅細胞”與相應(yīng)抗體作用可產(chǎn)生紅細胞凝集現(xiàn)象（圖2－1）。如此依次稀釋到第9管。常用于檢查HBsAg、甲胎蛋白、新型隱球莢膜抗原等可溶性抗原。依照表2－14．將血凝板置于微型振蕩器上振蕩1—2min，置37℃1h后觀察結(jié)果?！咀⒁馐马棥?．致敏的新鮮紅細胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，所以配制的致敏紅細胞懸液一般在當(dāng)天用完，若置2～10℃，使用期不超過3d。本次實驗以臨床上常用的檢測絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠試驗（preg nancy testing）為例。【結(jié)果分析】 如試驗格出現(xiàn)明顯凝集為陰性反應(yīng)，即HCG陰性；不出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，即HCG陽性。圖2－5 協(xié)同凝集試驗原理示意圖 【器材試劑】流行腦膜炎病人腦脊液（用前經(jīng)煮沸處理2min，并適當(dāng)稀釋）。取出混合液后，以3000r/min離心30min，棄上清，其沉淀物用PBS洗2次，%～%NaN3，制成2%懸液，放4℃冰箱保存?zhèn)溆茫话憧杀４?個月左右，其敏感性不變。實驗原理可溶性抗原（如血清、細菌浸出液、毒素等）和相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下可發(fā)生結(jié)合，經(jīng)過一定的時間，在二者比例適當(dāng)時形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（precipitation）。