【正文】 1．標(biāo)本 待檢人血清、標(biāo)準(zhǔn)血清(混合正常人新鮮血清)、人IgG標(biāo)準(zhǔn)品(或凍干人血清IgG參考標(biāo)準(zhǔn))。 2．抗原抗體比例需適當(dāng)，抗體過(guò)多時(shí)清晰的沉淀帶減少；抗原過(guò)多會(huì)出現(xiàn)弧線(xiàn)融合或消失。 2．若抗原抗體反應(yīng)形成的沉淀線(xiàn)很弱，肉眼難見(jiàn)，可將瓊脂板用生理鹽水浸泡10h (其間應(yīng)換液數(shù)次)，以去除未反應(yīng)的蛋白?？刂齐娏?～4mA／cm板寬，可終止電泳()。 3．器材 電泳儀、電泳槽、37℃溫箱、恒溫水浴箱、水平臺(tái)、載玻片、吸管、3mm打孔器、孔型樣板、尖頭棉簽棒、毛細(xì)滴管、手術(shù)刀片、濕盒等。甲酰化的方法：取待檢血清若干，％甲醛稀釋至分析要求的濃度，室溫30min，即可使蛋白質(zhì)分子中的氨基與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，該反應(yīng)抑制了蛋白質(zhì)分子中堿性基團(tuán)的解離，使其形成某種酸。6．如在抗原標(biāo)本中加入微量放射性核素，電泳后具有放射性的沉淀帶在暗室中可使膠片感光，感光峰比凝膠中肉眼可見(jiàn)的火箭峰高得多——此法稱(chēng)火箭電泳放射自顯影，檢測(cè)靈敏度可提高40～60倍。如欲永久保留，可將瓊脂板進(jìn)行染色干燥處理。 3．待瓊脂凝固后在瓊脂板的一端(距板端約5mm)打孔，孔徑3mm，孔間距6～8mm，孔的數(shù)目根據(jù)需要而定?？乖吭礁?，所形成的火箭峰就越長(zhǎng)。3．電泳時(shí)抗原、抗體電極方向不可放反。 【結(jié)果分析】1．待測(cè)孔與抗血清之間出現(xiàn)沉淀線(xiàn)為陽(yáng)性，否則為陰性。2．試劑 AFP診斷血清、 、15g/L瓊脂（ ）。2．每批試驗(yàn)均應(yīng)同步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。另外， 蒸餾水溶解，用生理鹽水稀釋成如下濃度：1∶1∶11∶1∶31∶40，分別加入另一套孔中，每孔中加10μl，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?！痉椒ú襟E】1．瓊脂準(zhǔn)備 吸取已熔化瓊脂59ml于三角燒瓶中，置56℃水浴保溫，將預(yù)溫的羊抗人IgG診斷血清1ml與瓊脂充分混合，繼續(xù)保溫于56℃?zhèn)溆谩?．為了使沉淀線(xiàn)保持清晰度，可在加樣完畢將瓊脂板置37℃下進(jìn)行擴(kuò)散，形成沉淀線(xiàn)后置室溫或4℃冰箱為佳。3．陽(yáng)性結(jié)果多在24h以?xún)?nèi)出現(xiàn)，48h不出現(xiàn)沉淀線(xiàn)可判為陰性結(jié)果。如用于檢測(cè)抗體特異性時(shí)，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有關(guān)抗原。若同時(shí)含有多種抗原抗體系統(tǒng)，根據(jù)抗原與抗體的性質(zhì)、純度和比例的不同，沉淀線(xiàn)的形狀、位置和數(shù)量不一。 【結(jié)果分析】1．1號(hào)試管兩液面交界處出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)，為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)陽(yáng)性，2號(hào)和3號(hào)試管為陰性。3．分別用牙簽混合均勻并不斷搖動(dòng)玻片，在日光燈下觀察結(jié)果，一般在幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)。制備過(guò)程為：選取能產(chǎn)生SPA的金黃色葡萄球菌Cowan I株接種在瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃孵育18—24h。注意不出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性，出現(xiàn)凝集為陰性。2．抗HCG抗體 與妊娠診斷試劑配套供應(yīng)。紅細(xì)胞經(jīng)醛化后體積略有增大，兩面突起呈圓盤(pán)狀。出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度即為HbsAg效價(jià)，凡效價(jià)1:16者需進(jìn)一步做中和試驗(yàn)。3．“V”型微量血凝板，微量攪拌器，刻度吸管，滴管（40滴/ml）?！窘Y(jié)果分析】凡紅細(xì)胞沉積于管底，集中呈一圓點(diǎn)的為不凝集（一）。4． “O”抗原的制備： 將傷寒桿菌O901接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng)18～24h，用生理鹽水洗下菌苔配制成每毫升含100億細(xì)菌的懸液，置100℃水中2h，離心沉淀，吸取上清液分裝于無(wú)菌試管，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨床上常用的直接試管凝集試驗(yàn)為肥達(dá)試驗(yàn)（Widal test）和外斐試驗(yàn)（WeilFelix test）。 將玻片輕輕晃動(dòng)，室溫下觀察結(jié)果， 【結(jié)果分析】 生理鹽水對(duì)照測(cè)不出現(xiàn)凝集，為均勻混濁的乳狀液。一般是用1滴已知診斷血清與1滴受檢菌液或細(xì)胞懸液，在玻片上混勻后，短時(shí)間內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果。反應(yīng)過(guò)程可分為兩階段：①抗原抗體的特異結(jié)合；②出現(xiàn)可見(jiàn)的顆粒凝集。由于佐劑具有緩釋作用，于佐劑一起免疫的抗原可隔1～2周。為了避免個(gè)體差異，每種抗原最好免疫3只以上動(dòng)物。除鹽后的球蛋白過(guò)陰離子交換柱（DEAE纖維素），根據(jù)不同類(lèi)別免疫球蛋白的等電點(diǎn)，選用不同pH和離子強(qiáng)度的緩沖液分別洗脫之；高滲或風(fēng)于法濃縮免疫球蛋白，若使用冷凍干燥器則可獲得干燥制品。⑸ 抗血清采集：頸動(dòng)脈放血或心臟采血獲得的兔血，置37℃促進(jìn)血塊收縮，并用毛細(xì)吸管吸取血清，經(jīng)3000r /min離心去除殘留的紅細(xì)胞。另外，也可將佐劑置磁力攪拌器上，邊攪拌，邊滴加抗原并繼續(xù)攪拌，使其完全乳化。⑵ 傷寒沙門(mén)菌O 抗原免疫方案：用于免疫動(dòng)物的菌液濃度視菌種的不同而異，傷寒沙門(mén)菌、志賀痢疾菌等腸道桿菌，免疫濃度多為109個(gè)/ml左右。 【器材試劑】 細(xì)菌菌種(傷寒沙門(mén)菌O901)、混合人全血清、健康家兔。在傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法中，尤其是作細(xì)菌的血清學(xué)鑒定時(shí)，抗血清即能滿(mǎn)足要求，無(wú)需純化，因?yàn)榧兓倪^(guò)程將造成免疫球蛋白的丟失。10．實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)清理實(shí)驗(yàn)用品，物歸原處。3．仔細(xì)、耐心地觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，及時(shí)、真實(shí)客觀地記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并積極思考，認(rèn)真分析，得出結(jié)論。1．基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn) 要求學(xué)生系統(tǒng)學(xué)習(xí)和掌握常用的經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，使學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識(shí)，掌握相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技能。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概 述免疫學(xué)是一門(mén)既古老又嶄新的學(xué)科，涉及醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，并與理工農(nóng)各學(xué)科相互滲透。一醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的開(kāi)設(shè)，目的在于不僅使學(xué)生驗(yàn)證部分理論知識(shí)和加深對(duì)課堂講授內(nèi)容的理解，更重要的是在掌握系統(tǒng)理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)和掌握免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)和技能，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析和解決問(wèn)題的能力，以及嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度和創(chuàng)新精神，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真地觀察教師的演示，嚴(yán)肅認(rèn)真地按規(guī)定步驟進(jìn)行操作。9．如有傳染性材料、有毒材料流灑與桌面、地面或衣服上，或發(fā)現(xiàn)割破皮膚、被動(dòng)物咬傷等意外時(shí)，要及時(shí)報(bào)告教師，做好妥善處理。免疫血清又稱(chēng)抗血清或抗體，而從抗血清中純化的免疫球蛋白則只能稱(chēng)為抗體。根據(jù)抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律，視抗原的性質(zhì)選擇不同的途徑免疫動(dòng)物，經(jīng)初次、再次免疫的過(guò)程，使得動(dòng)物血清中產(chǎn)生足量的特異性抗體，繼而分離血清并純化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗體。若制備鞭毛抗原，則可用含有5％石炭酸（苯酚）的生理鹽水洗下瓊脂平板上的菌苔，37℃溫育48h后作無(wú)菌試驗(yàn)，濾過(guò)后用生理鹽水配成一定濃度。2)注射器法：即用兩個(gè)注射器對(duì)接，使佐劑與抗原往返推拉，以至乳化。如效價(jià)不夠，可追加免疫。純化的步驟為：50%飽和硫酸銨鹽析以沉淀血清球蛋白，應(yīng)用透析或分子篩法除鹽。應(yīng)用的動(dòng)物必須健康，且以雄性為佳。4．免疫程序并非固定不變，一般而言，不與佐劑一同免疫的抗原，免疫間隔時(shí)間較短，可每隔2～3天免疫一次。反應(yīng)中的抗原稱(chēng)為凝集原（agglutinogen），抗體稱(chēng)為凝集素（agglutinin）。 （一）玻片凝集試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】玻片凝集試驗(yàn)（slide agglutination test）多用作定性試驗(yàn)。 用接種環(huán)取標(biāo)準(zhǔn)菌液少許于左格生理鹽水中混勻， 滅菌接種環(huán)，同樣方法取待檢菌液少許于右格診斷血清并混勻。在試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和pH不適當(dāng)?shù)仍?，可引起抗原的非特異性凝集，出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對(duì)照組。3． 2%綿羊紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、試管、吸管、37℃水浴箱。4． %綿羊紅細(xì)胞懸液，混勻后放入37℃水浴中2h觀察結(jié)果。2．配制致敏紅細(xì)胞懸液：于每瓶?jī)龈稍\斷紅細(xì)胞加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻紅細(xì)胞懸液，%。明顯凝集（++）：紅細(xì)胞于孔底形成簿膜狀凝集，中央可見(jiàn)疏松的紅點(diǎn)。常用的醛類(lèi)有甲醛、戊二醛、丙酮醛等?！酒鞑脑噭?．HCG致敏乳膠試劑 妊娠診斷試劑（有商品出售）。放置時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)5min。SPA菌穩(wěn)定液。2．然后第1格及第3格各加1滴病人腦脊液，第2格加1滴生理鹽水?！酒鞑脑噭?．標(biāo)本 人待檢血清 2．試劑 稀釋雞血清、抗人血清、生理鹽水 3．器材 沉淀小管（~3mm）或小試管、毛細(xì)吸管、試管架等 【方法步驟】 1．取3支沉淀小管，排列于試管架并作好標(biāo)記； 2．在1號(hào)； 3．再在1號(hào)； 4．室溫靜置10分鐘，觀察結(jié)果。當(dāng)二者相遇時(shí)發(fā)生特異性反應(yīng)，在濃度比例合適處形成可見(jiàn)的白色沉淀線(xiàn)。3．加樣 用微量加樣器向中央孔加入抗體（羊抗人IgG診斷血清），周?chē)准尤氪郎y(cè)抗原，其中第4孔加入陽(yáng)性對(duì)照血清，第6孔分別加入不同的待檢血清。2．在梅花孔型中，若相臨兩條沉淀線(xiàn)完全融合，說(shuō)明兩抗原部分相同；若相臨沉淀線(xiàn)發(fā)生交叉，說(shuō)明兩抗原完全相同。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補(bǔ)或?qū)傊逶诨鹧娓咛巵?lái)回通過(guò)幾次補(bǔ)底。3．器材 三角燒瓶、載玻片、打孔器、吸管、滴管、濕盒、水浴箱、微量加樣器和半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙等。如同時(shí)測(cè)定多個(gè)標(biāo)本，注意做好標(biāo)記，認(rèn)真記錄，不要搞混。【注意事項(xiàng)】1．澆制瓊脂板的事項(xiàng)同凝膠雙擴(kuò)散試驗(yàn)?！酒鞑脑噭?．標(biāo)本 待測(cè)人血清、陽(yáng)性對(duì)照血清。電泳30~90min后切斷電源，取出瓊脂板觀察結(jié)果。2．搭橋時(shí)應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會(huì)使電流不均勻，致使沉淀線(xiàn)歪斜、不均勻。整個(gè)沉淀帶的形狀呈火箭樣，故名火箭電泳。搖勻后迅速澆制瓊脂板。 6．電泳結(jié)束后，切斷電源，取下瓊脂板，如沉淀峰清晰可見(jiàn)，可直接判讀結(jié)果，否則將瓊脂板浸入10g／L鞣酸生理鹽水中10分鐘，可使沉淀峰更明顯。 5．與前述幾個(gè)電泳方法相比，火箭電泳操作簡(jiǎn)便省時(shí)，結(jié)果重復(fù)性好，／m1。4．，IgG、因此要使IgG、IgA等在電場(chǎng)中也向正極泳動(dòng)，應(yīng)先經(jīng)乙?；?、甲酰化或氨甲?；幚韥?lái)增加它們的負(fù)電荷。 2．試劑 兔抗人全血清、 ／L巴比妥緩沖液、12g／L瓊脂巴比妥液 凝膠、凝膠指示劑( )等。 3．電泳 將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳。如出現(xiàn)兩條以上沉淀線(xiàn)，則指示提取物不純。 【注意事項(xiàng)】 1．抗原與抗體均不能溢出孔外或槽外，防止沉淀線(xiàn)彎曲。在反應(yīng)系統(tǒng)中保持抗IgG抗體過(guò)量時(shí)，所形成的免疫復(fù)合物與血清IgG量呈正相關(guān)，而形成的濁度大小與入射光的衰減呈正相關(guān)，因此測(cè)定A值可反映液相中的抗原量，通過(guò)參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值的計(jì)算，即可得知待檢血清中IgG含量。分別做好標(biāo)記。標(biāo)準(zhǔn)血清的IgG含量應(yīng)該處于正常參考值的范圍以?xún)?nèi)，否則應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有問(wèn)題。其溶血程度與補(bǔ)體量呈正比，溶血程度在30％～70％的范圍內(nèi)，補(bǔ)體的用量稍有變動(dòng)即能影響溶血程度。如效價(jià)為1:4000，使用時(shí)按1:2000稀釋。求出兩者中更加接近標(biāo)準(zhǔn)管透光率的一管，根據(jù)此管中加入的稀釋血清的量，按下式求出總補(bǔ)體值，計(jì)算每ml血清中補(bǔ)體活性（U/ml）： 根據(jù)該公式計(jì)算出待測(cè)血清總補(bǔ)體活性單位，亦可在上表中查出總補(bǔ)體活性單位。受檢血清必須新鮮，如放置2h以上，會(huì)使補(bǔ)體活性下降。此反應(yīng)的直接用途是作為指示系統(tǒng)測(cè)定血清總補(bǔ)體活性或溶血素的效價(jià)，也可檢測(cè)另一反應(yīng)系統(tǒng)的抗原或抗體，即補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。【注意事項(xiàng)】補(bǔ)體在體外極易衰變，血清分離后應(yīng)及時(shí)使用，最好在當(dāng)日用完。參與本反應(yīng)的5種成分可分為2個(gè)系統(tǒng)：一為待檢系統(tǒng)：即已知抗原（或抗體）和待檢的抗體（或抗原）；二為指示系統(tǒng)，即綿羊紅細(xì)胞及其相應(yīng)溶血素：待檢的抗原、抗體和先加入的補(bǔ)體作用后，再加入指示系統(tǒng)，若不出現(xiàn)溶血，則為補(bǔ)體結(jié)合陽(yáng)性，表示待檢系統(tǒng)中的抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，兩者特異性結(jié)合后固定了補(bǔ)體，指示系統(tǒng)無(wú)補(bǔ)體結(jié)合，故不發(fā)生溶血。 2．抗體 用待檢血清（試驗(yàn)前56℃30min滅活）、溶血素（2個(gè)單位）。 四補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒試驗(yàn) 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒試驗(yàn)的基本原理，熟悉其操作過(guò)程和要求。2．抗體 兔抗小鼠T細(xì)胞多克隆抗體或單克隆抗體（如抗CD3單抗）。在200目不銹鋼網(wǎng)上，用5ml注射器針?biāo)ㄢg性擠壓按摩，使胸腺細(xì)胞釋出，并經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾。 表44 補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)各管加入的成份和量（ml） 試驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)管補(bǔ)體對(duì)照管 細(xì)胞對(duì)照管抗體對(duì)照管1107/ml小鼠胸腺細(xì)胞抗Thy1單克隆抗體（適當(dāng)稀釋度）Hanks1:3補(bǔ)體（經(jīng)胸腺細(xì)胞吸收） 混勻，置370C 水浴30 min1%伊紅Y染液混勻，置室溫2 min8% 戊二醛混勻，固定1 min【結(jié)果分析】于高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。HLA分型技術(shù)，已被廣泛用于器官和骨髓移植前供受者HLA配型、研究HLA與默寫(xiě)疾病的相關(guān)性、法醫(yī)鑒定、親子鑒定，以及遺傳學(xué)研究等。因此可根據(jù)死亡細(xì)胞的百分率，判定淋巴細(xì)胞表面HLA的型別?！痉椒ú襟E】1． 將凍存的含已知抗體的HLA血清板解凍，平衡至室溫。l，固定，終止反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)五 免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測(cè)方法，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)加以測(cè)定?！酒鞑脑噭浚℉AC－NaAC）緩沖液； （CBS 包被液）；NaBH4（或KBH4）臨用時(shí)用蒸餾水配成1mg/；%乙二醇 （）；6；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）； 待標(biāo)記的抗體。70％的酶與抗體結(jié)合，99％的抗體被酶結(jié)合。 器材（1）聚苯乙烯塑料板（簡(jiǎn)板酶標(biāo)板）40孔或96孔、ELISA檢測(cè)儀、50μl及100μl加樣器、塑料滴頭、小毛巾、洗滌瓶。然后洗滌。也可測(cè)OD值：ELISA讀數(shù)儀上，于波長(zhǎng)450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，即為陽(yáng)性。2．酶標(biāo)儀判定 采用反應(yīng)底物的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定OD值。（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純