【正文】 法的特異性和靈敏度。 ?比放射性 單位化學量標記物中所含的放射性強度 . 常用 Ci/g、mCi/mg、 Ci/mmol等單位表示。 ?免疫活性 標記過程中，被標記物活性損傷程度。 使用最廣泛的是： 125I ① 性質(zhì)活潑 、 易制備標記物 ② 對被標記物的免疫活性影響小 ③ 測量方法簡便 、 已推廣 ④ 半衰期較長 、 核素豐度高 免疫學及免疫學檢驗 標記方法 125I的標記 原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子 方法： ? 直接標記法 氯胺 T法和乳過氧化物酶法 ? 間接標記法 聯(lián)接標記法 免疫學及免疫學檢驗 適用分子 原理 特點 缺點 直接標記 肽類、蛋白質(zhì)、酶 存在酪氨酸、組胺殘基等基團 操作簡便、易標記、比放射性高 不適于活性功能區(qū)的殘基標記 間接標記 甾類化合物、核苷酸等小分子化合物 不存在酪氨酸、組胺殘基等基團 ,需添加 可避免氧化／還原劑對被標記物活性的損傷等 添加基團可能影響被標記物活性 免疫學及免疫學檢驗 標記物純化 對游離的 125I等試劑與標記物進行分離 方法：分子篩凝膠過濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）；高效液相色譜（ HPLC） 免疫學及免疫學檢驗 標記物鑒定 ?放射化學純度 單位標記物中結合在被標記物上的放射性占總放射性的百分率。標記免疫技術 醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室 二 OO四年三月 免疫學及免疫學檢驗 標記 免疫技術 = 抗原抗體反應 示蹤物標記 靈敏性 特異性 標記免疫技術的主要特點： 高特異性 、 高靈敏性 免疫技術 +標記技術 免疫學及免疫學檢驗 標記免疫技術 免疫測定技術 免疫組化技術 示蹤物及 標記技術 放射免疫技術 熒光免疫技術 酶免疫技術 化學發(fā)光技術 金免疫技術 ??? 免疫學及免疫學檢驗 第八章 放射免疫技術 類型： ? 放射免疫分析（ radioimmunoassay,RIA） ? 免疫放射分析（ immunoradiometric assay,IRMA） 廣義放射免疫技術還包括放射受體分析（使用受體測量抗原）和放射配體結合分析（使用配體研究受體）。 特點 :靈敏度高 (1091015g/L)、特異性強、 重復性好等 免疫學及免疫學檢驗 標記物 : 常用的核素有兩大類 γ 射線： 131I、 125I、 57Cr和 60Co β 射線： 14C、 3H和 32P。一般要求大于 95％。 B/T％ 80％， B/T％ ↑ 抗原損傷 ↓。 比放射性 ↑ 方法更靈敏；過高 輻射自損傷大，對標記物免疫活性影響大，儲存穩(wěn)定性差 。 ?親合力 選用親和常數(shù) K值大 (109~1012 L//mol)抗血清 ?特異性 其程度可直接影響結果的準確性 ?滴度 最大稀釋度。 免疫學及免疫學檢驗 放射免疫分析 （ RIA ） 基本原理 采用定量的標記抗原（ Ag＋ ）和非標記抗原（ Ag）競爭性結合有限量特異性抗體（ Ab）的反應。 B/F 60 (％ ) 50 40 30 20 10 Ag(ng/ml) 免疫學及免疫學檢驗 測定方法與步驟 ：平衡法或非平衡法 沉淀劑沉淀復合物，離心分離。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過程不影響反應平衡；操作簡便，重復性好且經(jīng)濟。 免疫學及免疫學檢驗 免疫放射分析（ IRMA） 基本原理 單位點 IRMA： 利用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物，反應平衡后，用固相抗原結合反應液中剩余的未結合標記抗體并將其分離，測定上清液的放射量。 免疫學及免疫學檢驗 免疫學及免疫學檢驗 IRMA與 RIA的異同點 ? 標記物 在 RIA中 核素標記抗原，抗原有不同種類，根據(jù)其化學結構，標記時需用不同的核素和不同的方法?？贵w為蛋白質(zhì)，有利于碘化標記，不同抗體標記方法基本相同。 ? 反應速率 反應速度與反應物的濃度呈正比，在 IRMA中標記抗體是過量的，而且不存在競爭性結合復雜的反應，所以反應速度較 RIA快。 免疫學及免疫學檢驗 ? 反應原理 RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反比。 ? 特異性 在雙位點 IRMA中，一般均應用針對不同位點的單克隆抗體，其交叉反應率低于應用多克隆抗體的RIA。 免疫學及免疫學檢驗 ? 分析誤差 RIA中加入的抗體和標記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴重影響測定結果。因此， IRMA的批內(nèi)和批間變異均比較小。在RIA中應用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求