【正文】 操作簡便，易于自動化，最常用。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如 HRP）標記物制備。如戊二醛交聯法。 * AP靈敏性高與 HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標記物收率 低于 HRP，且價高，故應用不如 HRP普及。 免疫學及免疫學檢驗 基本特點： ①標記后保留酶和抗原 (抗體 )的活性 ②酶促反應專一性，保證特異性 ③底物反應放大作用，提高敏感性 ④酶標試劑保存穩(wěn)定 ⑤操作簡便，安全易行 免疫學及免疫學檢驗 主要試劑的制備與要求 免疫學及免疫學檢驗 一、酶與酶作用底物 （一）用于標記酶的要求： ? 酶活性高 ? 標記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標記抗原與抗體的免疫反應性 ? 酶催化底物后信號易判定或測定 ? 酶活性不受樣品中其他成分的影響 ? 酶、輔助因子及底物理化性質穩(wěn)定，安全無害，價廉 免疫學及免疫學檢驗 （二）常用酶及其底物 （ HRP） 常用底物： ? 鄰苯二胺（ OPD）：反應顯橙黃色，應避光，致癌性 ? 四甲基聯苯胺（ TMB）：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差?？捎糜跈z測細胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于 T細胞亞群等的檢測。其突出優(yōu)點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應的組織成分，并能在同一組織中同時檢查抗不同組織成分的抗體。 ? 在寄生蟲感染診斷中，間接免疫熒光試驗（ IFAT）是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。 ? 免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷常用方法之一。既可檢測抗原，也可檢測抗體。效價在 1:161:32者較為理想 抗體特異性 ：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強烈熒光 免疫學及免疫學檢驗 第二節(jié) 免疫熒光顯微技術 基本原理 ：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光 。一般用于固定標本的熒光抗體以 F/P＝ ，用于活細胞染色的以 F/P＝ 。 免疫學及免疫學檢驗 熒光抗體是將熒光素（如 FITC）與特異性抗體以化學方式共價結合而成。 ④與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質，與蛋白質的結合物穩(wěn)定，易于保存。 ②熒光效率高 ,與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。 免疫學及免疫學檢驗 熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，一些化合物對熒光有猝滅作用，因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。 免疫學及免疫學檢驗 四甲基異硫氰酸羅丹明（ TRITC） 最大吸引光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為 620nm，呈 橙紅色熒光 。最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為 595－ 600nm，呈橘紅色熒光 。 免疫學及免疫學檢驗 免疫學及免疫學檢驗 四乙基羅丹明（ RB200） 為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。 免疫學及免疫學檢驗 第一節(jié) 熒光的基本知識 免疫學及免疫學檢驗 異硫氰酸熒光素（ FITC） 為黃色或橙黃色結晶粉末，分子量為 ，最大吸收光波長為 490495nm，最大發(fā)射光波長 520530nm，呈現明亮的 黃綠色熒光 ，是應用最廣泛的熒光素。 是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種方法。 問題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長不易自動化儀器分析等。 IRMA中標記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來源豐富、特異性較高的單克隆抗體。 ? 其他 RIA可以測定大分子量與小分子量的物質，雙位點IRMA只能測定在分子上具有 2個以上抗原表位的物質。 IRMA中標記和固相抗體在反應中都是過量的，只有受檢標本的加樣誤差才會影響分析結果。 ? 檢測范圍 通常 RIA的工作范圍為 23個數量級，而RIMA可達 3個數量級以上。 IRMA為非競爭結合，劑量反應曲線為正相關的直線關系。在 RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在 IRMA中應用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結果。標記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。在IRMA中 核素標記抗體。 免疫學及免疫學檢驗 免疫學及免疫學檢驗 ?雙位點 IRMA 先用固相抗體與抗原反應結合 ,然后再用過量的標記抗體與已結合于固相抗原的另一抗原決定簇結合 ,形成固相抗體 抗原 標記抗體復合物 ,洗棄反應液中剩余的標記抗體 ,測定固相上的放射性。 晶體閃爍計數儀 (γ射線 )或液體閃爍計數儀 ( β射線 ) 繪制標準曲線，計算待檢抗原濃度。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。 免疫學及免疫學檢驗 免疫學及免疫學檢驗 免疫學及免疫學檢驗 以未結合的 Ag*為 F， Ag*Ab復合物為 B，則 B/F與 Ag的量變存在著函數關系。在本技術方法中是指結合 50％標記抗原時的抗血清的稀釋度。 免疫學及免疫學檢驗 抗血清鑒定 多克隆抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑之一，其質量直接影響方