【正文】 【注意事項】 1．抗原與抗體均不能溢出孔外或槽外，防止沉淀線彎曲。所測抗原的蛋白含量一般應(yīng)在20g／L以下，若過高需用緩沖液稀釋。 七 免疫濁度測定 【目的要求】掌握免疫濁度測定的原理，熟悉其操作方法，了解其意義及應(yīng)用。這種濁度可以反射、散射和吸收入射的光線，使入射光衰減。在反應(yīng)系統(tǒng)中保持抗IgG抗體過量時，所形成的免疫復(fù)合物與血清IgG量呈正相關(guān)，而形成的濁度大小與入射光的衰減呈正相關(guān)，因此測定A值可反映液相中的抗原量，通過參照標(biāo)準曲線或標(biāo)準品數(shù)值的計算，即可得知待檢血清中IgG含量。 2．試劑 羊抗人IgG抗血清、生理鹽水、蒸餾水、PEG溶液 (PEG 6000～8000 、NaF 、NaHPO42H2O 、NaN3 ，加蒸餾水至100ml)等。 【方法步驟】 1．系列標(biāo)準管準備 用生理鹽水稀釋人IgG標(biāo)準品或人血清IgG工作標(biāo)準，／L、／L、／L、／L(濃度可根據(jù)不同制劑略有變動)。分別做好標(biāo)記。 3．抗體準備 用PEG溶液稀釋羊抗人IgG抗血清，注意保持適宜的抗體濃度。 5．測定 用分光光度計進行測定，使用340nm波長，用生理鹽水校正零點。 【結(jié)果分析】 1．以4個濃度IgG標(biāo)準品的A值為縱坐標(biāo)，以其分別的IgG含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準曲線。標(biāo)準血清的IgG含量應(yīng)該處于正常參考值的范圍以內(nèi)，否則應(yīng)考慮實驗結(jié)果可能有問題。血清IgG降低主要見于先天性低IgG血癥，亦可見于獲得性低免疫球蛋白血癥，／L；血清IgG升高主要見于各種感染性疾病、肝臟疾病(慢性活動型肝炎、原發(fā)行膽汁肝硬化等)和自身免疫病等。 【注意事項】 1．由于不同制品羊抗人IgG抗血清的效價不同，所以對每批制品都需要測定最適宜的抗體濃度。20g／L濃度只能沉淀較大復(fù)合物，40g／L濃度可沉淀 較小復(fù)合物，但濃度50g／L，PEG選擇性沉淀免疫復(fù)合物的特性即行消失。其溶血程度與補體量呈正比，溶血程度在30％～70％的范圍內(nèi)，補體的用量稍有變動即能影響溶血程度?！酒鞑脑噭堪捅韧拙彌_液（BB，）配儲存液2000ml： NaCl 85g，MgCl2 ，逐一加入熱蒸餾水中，溶解冷卻后，加蒸餾水至2000ml，過濾，4℃保存。2％SRBC懸液 新鮮脫纖維綿羊血或Alsever液保存羊血（4℃可用3周），以10倍NS洗三次，前兩次每次2000rpm5min，最后一次2500rpm10min。為使紅細胞濃度標(biāo)準化，取2％，（波長542nm），調(diào)T（透光率）＝40％。如效價為1:4000，使用時按1:2000稀釋?！痉椒ú襟E】制備1:20待測血清 抽取靜脈血于試管中，室溫下靜置，分離血清（2h以內(nèi)），用BB液稀釋為1:20?；靹颍礊?0％溶血標(biāo)準管。 表4－1 【結(jié)果分析】取各管先與50％溶血標(biāo)準管作初步目視比較，選擇與標(biāo)準管相接近的兩管。求出兩者中更加接近標(biāo)準管透光率的一管，根據(jù)此管中加入的稀釋血清的量，按下式求出總補體值，計算每ml血清中補體活性（U/ml）： 根據(jù)該公式計算出待測血清總補體活性單位，亦可在上表中查出總補體活性單位。本法測定補體的正常參考值為50～100U/ml?！咀⒁馐马棥看郎y標(biāo)本應(yīng)無溶血、無污染、無乳麋血。緩沖液、致敏羊紅細胞均應(yīng)新鮮配制。受檢血清必須新鮮，如放置2h以上，會使補體活性下降。當(dāng)每一致敏紅細胞吸附的補體分子低于100時，紅細胞溶血程度隨細胞濃度的增加而減少；當(dāng)用高濃度抗體致敏時，溶血程度隨細胞增加而增加。故在配2％SRBC和2單位的溶血素時，均應(yīng)盡可能標(biāo)準化和準確。因此，須對反應(yīng)的各個環(huán)節(jié)加以控制。此反應(yīng)的直接用途是作為指示系統(tǒng)測定血清總補體活性或溶血素的效價，也可檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)的抗原或抗體，即補體結(jié)合試驗。溶血素（2個單位）。生理鹽水、水試管、吸管、37℃浴箱。 表4－2 溶血反應(yīng) 試管號溶血素（2個單元）2%綿羊紅細胞補體（2個實用單位）生理鹽水置37℃20min結(jié)果（試驗管） （溶血素對照）— （補體對照）— （羊紅細胞對照）—— 【結(jié)果分析】溶血：液體呈紅色透明?！咀⒁馐马棥垦a體在體外極易衰變，血清分離后應(yīng)及時使用，最好在當(dāng)日用完。凍干制品可長期保存，但其活性都不同程度地比新鮮血清降低。溶血素即抗綿羊紅細胞抗體，多是以綿羊紅細胞免疫家兔而得到的兔抗血清。由于補體溶血試驗及補體結(jié)合試驗均是比較精密的試驗，其結(jié)果與溶血素的效價有關(guān)，所以試驗需要滴定溶血素效價；在制備抗血清的過程中，動物采血前和分離抗血清后也需要滴定溶血素效價（方法見附2）。參與本反應(yīng)的5種成分可分為2個系統(tǒng)：一為待檢系統(tǒng)：即已知抗原（或抗體）和待檢的抗體（或抗原）；二為指示系統(tǒng)，即綿羊紅細胞及其相應(yīng)溶血素：待檢的抗原、抗體和先加入的補體作用后，再加入指示系統(tǒng)，若不出現(xiàn)溶血，則為補體結(jié)合陽性，表示待檢系統(tǒng)中的抗原與抗體相對應(yīng)，兩者特異性結(jié)合后固定了補體，指示系統(tǒng)無補體結(jié)合，故不發(fā)生溶血。因此補體結(jié)合試驗可用已知抗原來檢測相應(yīng)抗體，或用已知抗體來檢測相應(yīng)抗原。由于參與反應(yīng)的各種成分之間要求有適當(dāng)量的關(guān)系。本次實驗以測定患者血清抗傷寒桿菌的抗體為例介紹。 2．抗體 用待檢血清（試驗前56℃30min滅活）、溶血素（2個單位）?！痉椒ú襟E】 取小試管5支，分別注明管號，按下表依次將各成分加入試管中（溶量單位均為ml） 表4－3試管號待檢血清生理鹽水抗原補體（2個實用單位）37℃水浴10min溶血素（2個單位）2%綿羊紅細胞37℃水浴30min結(jié)果1（試驗管）— 2（血清對照）— 3（抗原對照）— 4（溶血素對照）—— 5（SRBC對照）———— 【結(jié)果分析】 首先觀察各對管的結(jié)果是否正確，如不適合，試驗結(jié)果的可靠性應(yīng)加考慮。以100%不溶血為強陽性，50％不溶血為陽性，完全溶血者為陰性。2．待檢血清需56℃30min滅活。 四補體依賴的細胞毒試驗 【實驗?zāi)康摹?掌握補體依賴的細胞毒試驗的基本原理，熟悉其操作過程和要求。靶細胞的死活可借染料排斥現(xiàn)象（活細胞不著色）加以判斷。此試驗可用于檢測細胞的膜抗原或相應(yīng)的抗體。本次試驗檢測小鼠T淋巴細胞表面分子（抗原）。2．抗體 兔抗小鼠T細胞多克隆抗體或單克隆抗體（如抗CD3單抗）。4．染料 1%伊紅Y染液。6．解剖器械 眼科剪、眼科鑷、平皿、小玻璃漏斗、200目不銹鋼網(wǎng)、5ml注射器針?biāo)??！痉椒ú襟E】1．胸腺細胞懸液的制備（1）采用眼球摘除放血或拉脫頸椎法處死小鼠，用碘酒、酒精消毒皮毛。在200目不銹鋼網(wǎng)上，用5ml注射器針?biāo)ㄢg性擠壓按摩，使胸腺細胞釋出，并經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過濾。棄上清，沉積的胸腺細胞用冷Hanks液洗滌兩次后，記數(shù)并用Hanks液配成1107/ml淋巴細胞懸液。2．細胞毒實驗（1）取4支試管，做好標(biāo)記，按表44所示依次加入各成分。（2）每管加入1% ml，混勻，室溫靜置2 min 。 表44 補體介導(dǎo)的細胞毒試驗各管加入的成份和量（ml） 試驗材料實驗管補體對照管 細胞對照管抗體對照管1107/ml小鼠胸腺細胞抗Thy1單克隆抗體（適當(dāng)稀釋度）Hanks1:3補體（經(jīng)胸腺細胞吸收） 混勻，置370C 水浴30 min1%伊紅Y染液混勻，置室溫2 min8% 戊二醛混勻，固定1 min【結(jié)果分析】于高倍鏡下計數(shù)200個細胞，計算死細胞的百分數(shù)?！咀⒁馐马棥?．因細胞活性直接影響試驗結(jié)果，故在處死動物前，要做好實驗準備工作，力求在盡可能短的時間內(nèi)制備好胸腺懸液，完成整個實驗。3．抗T細胞單克隆抗體和補體的稀釋度，要按效價在預(yù)試驗中確定。5．觀察結(jié)果時，鏡檢操作要熟練、準確、快速，時間過長，著色細胞就會增多。HLA分型技術(shù)，已被廣泛用于器官和骨髓移植前供受者HLA配型、研究HLA與默寫疾病的相關(guān)性、法醫(yī)鑒定、親子鑒定，以及遺傳學(xué)研究等。HLA血清學(xué)分型法，是應(yīng)用一系列已知的抗HLA特異性標(biāo)準分型血清（抗體）與待檢淋巴細胞混合，再加入一定量的補體進行孵育。由于該分型試驗是在微量反應(yīng)板中進行，分型血清、淋巴細胞和補體用量少，故稱為補體歷來的微量細胞毒試驗?！净驹怼? 將待檢淋巴細胞加入含有各種已知抗HLA標(biāo)準血清的微孔板（定型血清板）中，則淋巴細胞與相應(yīng)的抗HLA抗體結(jié)合，繼而在補體作用下發(fā)生細胞膜破壞、死亡。因此可根據(jù)死亡細胞的百分率，判定淋巴細胞表面HLA的型別。如欲檢測HLADR、DQ抗原，需用富含B 細胞的懸液。隨分型板附有個孔包被的標(biāo)準分型血清位置表，以表可知分型板各孔包被的為何標(biāo)準血清，并表明了陽性和陰性對照位置。4．試劑 5%伊紅Y水溶液、液體石蠟、12%中性甲醛（用1mol/L NaOH ）?！痉椒ú襟E】1． 將凍存的含已知抗體的HLA血清板解凍，平衡至室溫。l,混勻后置室溫（220C）30 min。l，混勻后置室溫60min。l，混勻后置室溫3~5min。l，固定，終止反應(yīng)?！窘Y(jié)果分析】在低倍倒置相差顯微鏡下，每孔計數(shù)100個細胞，并計算死細胞的百分率，判定標(biāo)準及其意義見表45。2．選用的分型血清板所含標(biāo)準抗血清種類應(yīng)覆蓋本地區(qū)或本民族80%以上的HLA抗原，其中每一項高頻抗原相應(yīng)的特異性抗體為3份以上，低頻抗原相應(yīng)特異性抗體為2份以上。且對淋巴細胞無天然毒性作用。 實驗五 免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進行的檢測方法，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。如將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標(biāo)記物（例如用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)或生物發(fā)光劑等）進行標(biāo)記，則在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測定抗原抗體復(fù)合物本身，而是測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的放大作用，進一步提高了免疫技術(shù)的敏感性，這就是免疫標(biāo)記技術(shù)。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)在敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍等方面遠遠超過一般免疫血清學(xué)方法。 一 酶免疫技術(shù) 酶免疫技術(shù)（immunoenzymetic technique）是將抗原和抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計加以測定。所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平對其進行定量。通過以下實驗，應(yīng)掌握各項實驗的基本原理。本次實驗采用改良過碘酸鹽氧化法，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體?！酒鞑脑噭浚℉AC－NaAC）緩沖液； （CBS 包被液）；NaBH4（或KBH4）臨用時用蒸餾水配成1mg/；%乙二醇 （）；6；辣根過氧化物酶（HRP）； 待標(biāo)記的抗體。%（穩(wěn)定劑），室溫下30min。加入NaBH4（或KBH4），混勻，4℃作用2h，然后至透吸袋中， PBS透吸，4℃過夜（換液2～3次）?！窘Y(jié)果分析】用酶聯(lián)免疫吸附試驗對標(biāo)記結(jié)果進行判定，必要時用標(biāo)準酶標(biāo)抗體進行對比分析。70％的酶與抗體結(jié)合，99％的抗體被酶結(jié)合。 （二）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）【實驗原理】先將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，再加入酶標(biāo)抗體或抗原，最后加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行定性或定量分析?！酒鞑脑噭繕?biāo)本 待檢血清，陰性對照血清，陽性對照血清。 器材（1）聚苯乙烯塑料板（簡板酶標(biāo)板）40孔或96孔、ELISA檢測儀、50μl及100μl加樣器、塑料滴頭、小毛巾、洗滌瓶。（3）4℃冰箱、37℃孵育箱。4℃過夜。（簡稱洗滌，下同）。然后洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）。（4）加底物液顯色：，37℃10～30min。（6）結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強；陰性反應(yīng)為無色或極淺。也可測OD值：ELISA讀數(shù)儀上，于波長450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，即為陽性。次日洗滌3次。同時做空白、陰性及陽性孔對照。（4）其余步驟同“雙抗體夾心法”的6。2．酶標(biāo)儀判定 采用反應(yīng)底物的最大吸收波長測定OD值?！咀⒁馐马棥空綄嶒灂r，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制實驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式兩份，以保證實驗結(jié)果的準確性。在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙稀、聚苯乙稀、聚丙酰胺和纖維素等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度好，～。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（、）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的吸光度OD值。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為（1～10mg/L）。（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而