【正文】 山羊和狗的血清凝集價大于或等于1:50，判為陽性，1:25的凝集價判為疑似反應（可疑）。－：抗原完全未凝集，上清液完全渾濁不透明，但由于菌體的自然下沉，在管底中央出現(xiàn)規(guī)則的菌體自沉圓點，振蕩后立即散開呈均勻混濁。＋＋：50％抗原凝集，上清液渾濁半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明顯的凝集）。＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混濁，菌體大部分被凝集沉于管底，振蕩時情況如上。根據(jù)各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集塊的形狀，來判定凝集反應的程度。 表11 布氏桿菌病試管凝集試驗術(shù)式表（單位：ml）試 管 號1234567對 照 管最終血清稀釋度1：251：501：1001：200抗 原陽性血清陰性血清1：251：25%石炭酸生理鹽水被檢血清抗原(1：20) 5. 感作（反應）：7支試管加完抗原后，充分混勻，置于37℃溫箱中410h，取出后置室溫1824h（或37℃溫箱1214h，取出后置室溫24h；或37℃溫箱中2224 h取出），然后觀察并記錄結(jié)果。3. 對照管制作：% ml ，第6管加1: ml ，第7管加1: ml 。2. 被檢血清稀釋： ml % 石炭酸生理鹽水，第 ml % 石炭酸生理鹽水； ml ，加入第1管中，反復吹吸5次混勻， ml 棄之， ml 加入第2管中， ml 加入第3管，依此類推至第4管， ml （見表11）。1. 試管準備：每份血清用試管4支，另取3支試管作為對照，作好標記，置試管架上。4. 雞白痢平板凝集抗原，雞白痢陽性血清，雞白痢陰性血清，被檢雞血清。2. 滅菌的生理鹽水，%石炭酸生理鹽水。3. 熟悉平板凝集試驗和試管凝集試驗所需材料和試劑。[目的要求]1. 掌握平板凝集試驗和試管凝集試驗的操作方法。根據(jù)是否出現(xiàn)凝集反應及其程度，對待測抗原或待測抗體進行定性、定量測定。細菌或其它凝集原都帶有相同的負電荷，在懸液中相互排斥而呈現(xiàn)均勻的分散狀態(tài)。動物免疫學實驗指導第二版徐春厚 謝為天 雍艷紅 編動物醫(yī)學 生物技術(shù)專業(yè)用廣東海洋大學教材科出版二00七年二月二十八日目 錄實驗一 凝集試驗………………………………………………………1實驗二 沉淀試驗………………………………………………………4實驗三 溶血試驗………………………………………………………8實驗四 病毒的血凝及血凝抑制試驗 ………………………………10實驗五 E玫瑰花環(huán)試驗 ……………………………………………13實驗六 EA玫瑰花環(huán)試驗 ……………………………………………15實驗七 EAC玫瑰花環(huán)試驗……………………………………………17實驗八 酶聯(lián)免疫吸附試驗 …………………………………………18實驗九 熒光抗體技術(shù) ………………………………………………20實驗十 多克隆抗體（免疫血清）的制備 …………………………22 實驗一 凝集試驗顆粒性抗原(細菌、螺旋體、紅細胞等)與相應抗體結(jié)合后，在有適量電解質(zhì)存在下，抗原顆?？上嗷ツ扇庋劭梢姷哪瘔K，稱為凝集反應(Agglutination reaction)或凝集試驗。參與凝集反應的抗原稱為凝集原（Agglutinogen），抗體稱為凝集素（Agglutinin）?？乖c相應抗體相遇后可以發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原抗體復合物，降低了抗原分子間的靜電排斥力，此時已有凝集的趨向，在電解質(zhì)（如生理鹽水）參與下，由于離子的作用，中和了抗原抗體復合物外面的大部分電荷，使之失去了彼此間的靜電排斥力，分子間相互吸引，凝集成大的絮片或顆粒，出現(xiàn)了肉眼可見的凝集反應。凝集反應包括直接凝集反應和間接凝集反應兩大類，本實驗主要介紹直接凝集反應。2. 掌握凝集試驗的結(jié)果判定及判定標準。[材料與試劑]1. 玻板，載玻片，試管（1cm x 8cm），試管架，刻度吸管，滴管，微量可調(diào)加樣器，滴頭（tip頭），牙簽或火柴棒，記號筆。3. 布氏桿菌病試管凝集抗原，布氏桿菌病平板凝集抗原，布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原，布氏桿菌病陽性血清，布氏桿菌病陰性血清，被檢血清（牛、羊或豬）。[實驗內(nèi)容及操作方法]（一）試管凝集試驗以牛布氏桿菌病試管凝集試驗為例。如被檢血清有多份，對照只需做1份。該被檢血清的稀釋度分別是1:、1:21:50、1:100。4. 加抗原：% 石炭酸生理鹽水作1:20稀釋， ml 。6. 結(jié)果判定：判定結(jié)果時用“+”表示反應的強度。＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底，振蕩時，沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀。（管底凝集物與100%凝集時相同，只是上清液稍渾濁）。＋：25％抗原凝集，上清液完全渾濁不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕跡。7. 判定標準：能使50% 抗原凝集的血清最高稀釋度稱為該血清的凝集價（或稱滴度）。[注意事項]1. 實驗時必須設抗原、陽性血清及陰性血清對照，以避免假陽性、假陰性的結(jié)果。陽性畜群，重檢時仍為可疑，可判為陽性。（二）布氏桿菌病平板凝集試驗1. 加血清：取潔凈玻板一塊，用蠟筆劃成方格（4cm2），并注明被檢血清號碼，以100mL微量可調(diào)加樣器按下列量加被檢血清于方格內(nèi)，第l格80mL、第2格40mL、第3格20mL、第4格10mL。每一份檢樣需換一個tip頭。2. 加抗原：每格加布氏桿菌病平板凝集抗原30mL，滴在血清附近，而不與血清接觸?？乖们皳u勻，并置室溫使其溫度達20℃左右。4. 對照：每次試驗須用標準陽性血清和陰性血清以及生理鹽水作對照。＋＋＋＋：出現(xiàn)大的凝集塊，液體完全透明，即100% 凝集。＋＋：有可見凝集塊，液體不甚透明，即50% 凝集。－：液體均勻混濁，無凝集現(xiàn)象。表12 平板凝集試驗與試管凝集試驗的關(guān)系平 板 凝 集80mL40mL20mL10mL相當于試管凝集1:251:501:1001:2007. 判定標準：同試管凝集試驗。（三）虎紅平板凝集試驗這種試驗是快速平板凝集試驗?；⒓t平板凝集試驗可與試管凝集試驗及補體結(jié)合試驗效果相比，具有操作簡單、快速、特異性強的優(yōu)點。在室溫（20℃）410min內(nèi)記錄反應結(jié)果。 2. 結(jié)果判定：在陽性血清及陰性血清試驗結(jié)果正確的前提下，被檢血清出現(xiàn)任何程度的凝集現(xiàn)象均判為陽性，完全不凝集的判為陰性，無可疑反應。（四）雞白痢平板凝集試驗1. 被檢雞血清和雞白痢平板凝集抗原各1滴（約30mL）滴于玻板或載玻片上，用牙簽或火柴棒充分混合。[思考題]1. 凝集反應的原理是什么?2. 哪些因素影響細菌凝集試驗?3. 凝集試驗中為什么要設陽性、陰性血清及抗原對照？實驗二 沉淀試驗可溶性抗原(如細菌浸出液、含菌病料浸出液、病毒、血清以及其他來源的蛋白質(zhì)、多糖、類脂等)與其相應的抗體結(jié)合后，在電解質(zhì)參與下，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀反應(Precipitation reaction)。沉淀反應主要包括有環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂擴散沉淀試驗及免疫電泳等。2. 掌握瓊脂擴散沉淀試驗的原理和操作方法。[材料與試劑]1. ，毛細滴管，載玻片，平皿，燒杯沒，打孔器，針頭，酒精燈，加樣器（移液器），滴頭，電泳槽，電泳儀等。3. 炭疽沉淀抗原（炭疽標準抗原），炭疽沉淀素血清，待檢抗原。5. 小鵝瘟瓊擴抗原，小鵝瘟抗血清；雞傳染性法氏囊病瓊擴抗原（或待檢法氏囊組織浸提液），雞傳染性法氏囊病陽性血清。目前在鏈球菌的分類、鑒定，昆蟲吸血性能及所吸血液來自何種動物的鑒別，肉品種屬鑒定及炭疽尸體與皮張的檢驗工作中仍然應用。1. 待檢抗原的制備(1) 取疑為炭疽死亡動物的實質(zhì)臟器1g放入小燒杯中剪碎，加生理鹽水510ml，煮沸30min，冷卻后用濾紙過濾使之呈清澈透明的液體，即為待檢抗原。先將樣品高壓滅菌30min后，皮張剪為小塊并稱重，% 石炭酸生理鹽水，置室溫浸泡1024h。2. 加樣：， ml 的炭疽沉淀素血清(用毛細滴管加，注意液面勿有氣泡)。另2支小試管，一支加炭疽沉淀抗原，另一支加生理鹽水，方法同上，作為對照。對照組中，加炭疽沉淀抗原者應出現(xiàn)白環(huán)，而加生理鹽水者應不出現(xiàn)白環(huán)。（二）瓊脂擴散沉淀試驗瓊脂擴散沉淀試驗（Agar gel precipitation test，AGPT）是沉淀反應的一種形式。1% 瓊脂凝膠形成網(wǎng)狀構(gòu)架，空隙中是98%99% 的水，允許分子量在200ku以下分子通過。二者在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處結(jié)合成復合物，此復合物因顆粒較大而不能擴散，故形成沉淀