【正文】 是非特異性的，但病毒的凝集紅細胞的能力可被相應的特異性抗體所抑制，即血球凝集抑制(HI)試驗，具有特異性。2. 生理鹽水，% 雞紅細胞懸液。3. % 雞紅細胞懸液50mL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結果（表41）。從表41看出，該新城疫病毒液的血凝價為1:128，則l:128為1個血凝單位，1:6l:32分別為4個血凝單位，或將128/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。4. 自第1孔至12孔各加50mL 4個血凝單位的新城疫病毒液，其中第11孔為4單位新城疫病毒液對照，振蕩混合均勻，置室溫中作用10min 。凡被已知新城疫陽性血清抑制血凝者，該病毒為新城疫病毒。3. 96孔微量反應板的清洗將浸泡有75% 乙醇的棉簽放入微量反應板的每個孔內(nèi)旋轉，用自來水沖洗反應板5次，再用蒸餾水沖洗3次以上，置37℃溫箱中干燥。[目的要求] 1. 掌握E玫瑰花環(huán)試驗的原理及操作方法。 3. % 戊二醛溶液：25% ，Hank’ ml，用前配制。3. 方法3 取豚鼠肝素抗凝血2 ml ，置37℃水浴中靜置3040min，吸取上層白細胞與血漿的混合液（約1 ml）；于混合液中加Hank’s液數(shù)毫升，1500r/min離心510 min，棄上清，重復用Hank’s液洗滌4次，沉淀均勻即為淋巴細胞懸液。2. 37℃水浴15min，600r/min離心5min，吸棄上清液，4℃作用24h。6. 結果判斷：凡吸附3個以上RRBC的淋巴細胞判為一個E花環(huán)形成細胞。Fc受體并非B細胞所特有，中性粒細胞、單核細胞及巨噬細胞表面均有這種受體，但這些細胞可以通過形態(tài)學加以區(qū)別。[材料與試劑]1. 試管，滴管，吸管，注射器，載玻片，蓋玻片，血球計數(shù)板，雞，家兔等。4. 抗雞紅細胞抗體的制備（溶血素）：參見實驗十，溶血素凝集價為1:2000。4. 取出后，將沉淀輕輕搖起，加1% ，混勻后置4℃固定30min。2. 淋巴細胞、紅細胞均應新鮮，否則花環(huán)形成率明顯下降。2. 熟悉EAC玫瑰花環(huán)試驗的操作方法。2. ，加入4% ，混勻，室溫作用30min，1000r/min離心5min，吸棄過多的上清液，置4℃ 24h。2. 補體應現(xiàn)用現(xiàn)采集。本試驗將抗原抗體反應的特異性與酶的高催化活性相結合，使測定方法達到很高的敏感性，且特異性強，可用于生物活性物質的微量檢測及疾病診斷，廣泛應用于整個生命科學領域。2. （）， （%土溫20）， 2mol/L H2SO4，（包被液），封閉液，鄰苯二胺（OPD），3% H2O2，檸檬酸鹽緩沖液。2. 洗滌：以PBST沖洗酶標板，共洗5次，每次3min。6. 洗滌：同上。注意: 每塊ELISA板均需在最后一排的后3孔設立陽性對照、陰性對照和空白對照。4. 加待檢IBDV抗原：每孔加100mL 待檢IBDV抗原，同時設立陰、陽性對照，37℃孵育4590min ；PBST洗3次，每次3min。9. 結果判定：在酶標儀上讀取OD值（波長490nm），當OD≥，并且P/N≥，為陽性。[目的要求]1. 掌握熒光抗體染色法診斷豬瘟的基本操作步驟。4. 碳酸鹽緩沖液：。3. 染色：在晾干的標本片上滴加豬瘟熒光抗體（工作濃度），以覆蓋為度，放濕盒內(nèi)置37℃染色30min。6. 鏡檢：將染色后的標本片置熒光顯微鏡下觀察，先用低倍物鏡選擇適當?shù)臉吮緟^(qū)，然后換高倍物鏡觀察。陰性結果：五熒光或熒光微弱，細胞形態(tài)不清晰。具有免疫原性的抗原可刺激機體內(nèi)相應的B細胞增殖、分化，形成漿細胞并分泌特異性抗體。2. 掌握免疫原的制備方法。4. 雞紅細胞，10% 雞紅細胞，50% 雞紅細胞，雞，家兔。第6次改用靜脈注射50% 壓積紅細胞懸液1ml，1日1次，連注3天。(3) 程序3：選用體重3～4 ㎏ 的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。末次注射后7d采血，分離血清，分裝，20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ笫止潭ㄐ呐K，右手用50ml注射器（連接16號針頭），傾斜45℃，對準心搏動最強處刺入心臟抽血直至死亡。結扎遠心端，近心端的動脈用血管夾夾住。三角燒瓶中的血液先放37℃溫箱2h，用細玻棒將血塊與瓶壁剝離，4℃冰箱過夜，使血清充分析出。C高壓蒸汽滅菌30 min后即為油相。(3) 穩(wěn)定性檢驗：將制好的含佐劑抗原，于半徑為10cm的離心器中，以3000r/min離心15min，沒有發(fā)生分層，可以判斷其性質穩(wěn)定。(2) 程序2：選用體重2～3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性)，先飼養(yǎng)觀察7天。[思考題]1. 家兔在免疫前為什么先飼養(yǎng)觀察7天？2. 制備溶血素時，免疫原為什么不用加佐劑？3. 你還有其它的制備溶血素或抗菌抗體的免疫程序么？26。4. 抗血清效價的測定用布氏桿菌試管凝集試驗（參見實驗一中的布氏桿菌試管凝集試驗操作方法）對抗血清進行凝集效價的測定。3. 家兔免疫程序(1) 程序1：選用體重2～3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性)，先飼養(yǎng)觀察7天。(3) 乳化：油相（放至室溫后）與水相按1:1比例混合。將血清按1:100的比例加入1% 硫柳汞，分裝于滅菌的小瓶內(nèi)，封口，貼上標簽，注明免疫血清的名稱，效價及制備日期，放置低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中，一般一只家兔可放血80100ml。頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸動脈后并使之游離。效價達1:2000以上者為合格。(4) 程序4：選體重3～4㎏的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。(2) 程序2：選用體重3～4 ㎏ 的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。 家兔免疫程序(1) 程序1：選用體重2～3 ㎏ 的健康家兔，先飼養(yǎng)觀察7天。[材料與試劑]1. 試管，離心管，注射器，平皿，三角燒瓶，2. 肝素液，Hank’s液，生理鹽水，白油，司本80，吐溫80，硬脂酸鋁等。另外，根據(jù)機體產(chǎn)生免疫應答的特點，需要多次重復注射免疫原，才能產(chǎn)生高效價及高親和力的抗體。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑，也可供特異性免疫治療用。7. 結果判定陽性對照應呈翠綠色熒光，而豬瘟自發(fā)熒光對照組和抑制試驗對照組應無熒光。5. 封載：染色片半干時，滴加緩沖甘油封片。[操作方法]1. 切片制備：將冰凍的扁桃體或腎臟進行切片，置載玻片上，空氣中自然干燥后，立刻在室溫下放入純丙酮固定15min。[材料與試劑]1. 載玻片，蓋玻片，冰凍切片機，熒光顯微鏡，2. （）。該技術將血清學的特異性和敏感性與顯微技術的精確性結合起來，解決了生物學上的許多難題，如病毒的侵襲途徑及其感染細胞內(nèi)復制部位的研究，以及抗體的產(chǎn)生部位等。6. 加底物溶液：每孔加底物溶液（OPD和 H2O2）100mL ，37℃避光作用20min。2. 洗滌：PBST沖洗酶標板，共洗3次，每次3min。8. 終止反應：每孔加2mol/L H2SO4溶液100mL終止反應。4. 洗滌：同上。4. 雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）特異性抗體，IBDV抗原，待檢IBDV抗原，酶標抗IBDV的單克隆抗體。2. 了解豬群豬瘟抗體監(jiān)測的意義及雞傳染性法氏囊病病毒檢測的方法。其基本過程是將抗原或抗體吸附于固相載體上，在載體上進行免疫酶染色，底物顯色后以肉眼或酶標儀檢測結果。4. 結果判定：同EA玫瑰花環(huán)試驗。2. 補體：當日采集豚鼠混合血清，用Hank’s液稀釋成1:100，置4℃保存?zhèn)溆谩嶒炂? EAC玫瑰花環(huán)試驗B淋巴細胞表面有補體受體，紅細胞可與相應的抗體(溶血素)結合形成抗原抗體復合物(EA)，通過補體經(jīng)典途徑活化補體，而產(chǎn)生活化的C3， C3 與EA及B細胞結合，形成花環(huán)，即EAC玫瑰花環(huán)，以供計數(shù)B淋巴細胞。6. 結果判定：凡1個淋巴細胞結合3個以上雞紅細胞即為EA花環(huán)形成陽性細胞，共計數(shù)200個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。2. EA懸液的制備：取4% 雞紅細胞懸液2ml加入試管中，再加等量的1:4000 稀釋的溶血素，混勻，37℃水浴15min，取出后離心，以Hank’s液洗2次，再以2ml Hank’s液懸浮，即為4%的EA懸液。3. 雞紅細胞懸液的制備：由于綿羊紅細胞易于與T淋巴細胞形成E玫瑰花環(huán)，造成混淆，所以一般在檢測B淋巴細胞時，采用雞紅細胞。[目的要求]1. 掌握EA玫瑰花環(huán)試驗的原理及操作方法。 E玫瑰花環(huán)形成細胞數(shù)E玫瑰花環(huán)形成率 = 100% 計數(shù)的淋巴細胞總數(shù)[思考題]1. E玫瑰花環(huán)試驗的操作方法。4. 將潔凈的載玻片用Hank’s液沾濕，滴一小滴細胞懸液，讓其自然散開即可。2. 用Hank’s液反復洗滌紅細胞三次，每次2000r/min離心10min ，再以Hank’s液配成10% RRBC懸液。[