【正文】 被消耗，此時再往尿中加入膠乳抗原 (吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳膠顆粒 )。 (二 )間接凝集抑制試驗 若使可溶性抗原與相應(yīng)抗體先混合，充分作用后再加入有關(guān)的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象，叫間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝集抑制試驗。 (4)于每管加入 毫升已經(jīng)致敏的 %綿羊紅血球懸液，混勻后放入 37℃水浴中 2 小時后觀察結(jié)果。自第 8 管吸出 毫升棄去。 (3)以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清 毫升加入第 1 管，混勻后吸取 毫升注入第 2 管，同樣第 2 管的血清與鹽水混勻后吸取 毫升注入第 3 管。 3．試驗步驟： (1)小試管 9 只標(biāo)好號碼于試管架上。 2． 致敏紅血球懸液制備： 取一定稀釋度的抗原加等量 %綿羊紅血球懸液，混合后放 37℃水浴箱中，每隔 15 分鐘取出振搖一次，共經(jīng) 2 小時。但如系蛋白質(zhì)時則用來吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。這種致敏的紅血球具有細(xì)菌的抗原性，與相應(yīng)的抗血清相遇可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。 (一 )間接血球凝集試驗 間接血球凝集試驗是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來的。 二．間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒載體上，然后與相應(yīng)的抗體結(jié)合，也可出現(xiàn)顆粒載體的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。如血清的最高稀釋度 (即第6 管 1： 1280)仍顯完全凝集現(xiàn)象。通常以能產(chǎn)生明顯凝集 (++)的血清大稀釋倍數(shù)作為該血清的 凝集效價?！?O”菌液凝集呈緊密顆粒狀，沉于管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。 4．輕輕振蕩各管，觀察凝集塊的狀態(tài)，對照管的細(xì)菌在振蕩時呈煙霧狀上升，隨即消散，細(xì)菌分散仍呈混濁狀態(tài)。 3．試驗管應(yīng)自第 1 管看起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物，上清則澄清透明或不同程度混濁。 2．先看對照管，此管應(yīng)無凝集現(xiàn)象，管內(nèi)液體仍成混濁狀態(tài)。 6． 將各管振蕩混勻，放 37℃水浴箱中 2— 4 小時或 37℃孵育箱中過夜次日取出觀察結(jié)果。 4．用移液管吸取傷寒桿菌 H菌液，加收第 1排各管中每管 (由鹽水對照管開始，依次由后向前加入 )此時血清稀釋倍數(shù)又增加了一倍。第 7 管不加血清作為對照。依次類推，稀釋到第 6 管，自第 6 管吸出 毫升棄去。 方法： 1．取潔凈小試管 14 只分兩排排列于試管架上，每排 7 只依次用蠟筆注明號碼，于每管中分別加入 毫升生理鹽水。 2．菌液：傷寒桿菌“ H”菌液，傷寒桿菌“ O” 菌液。 (二 )試管凝集反應(yīng) 為一種定量試驗，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其相對含量。 4．輕輕搖動玻片，經(jīng) 12 分鐘后肉眼觀察，出現(xiàn)乳白色凝集塊者，即為陽性反應(yīng)；仍為平等的乳濁液者，即為陰性反應(yīng)。此時取菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。無菌 操作下，用接種環(huán)于 2 格內(nèi)加 1： 10 稀釋傷寒桿菌診斷血清 12 滴，第三格加 12 滴生理鹽水。 一．直接凝集反應(yīng) 顆?？乖c抗體直接結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象叫直接凝集反應(yīng)。 凝集反應(yīng)廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷和各種抗原性質(zhì)的分析。同單向瓊脂擴散法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出待檢血清中 Ig 含量。 4．把加完樣的免疫瓊脂板放入電泳槽中進(jìn)行電泳，電壓 4— 6 伏 /厘米，電泳時間 1— 5 小時，直到大部分抗原孔前端出現(xiàn)頂端尖窄而完全閉合的火箭狀沉淀線，關(guān)閉電源。 材料： 1．診斷血清 (抗體 )：抗人 IgG或 IgA 免疫血清 2．待檢血清 (抗原 )：人血清 3．參考血清 4． ，離子強度 巴比妥緩沖液配制 (見對流免疫電泳試驗 ) 5．其它：瓊脂粉，微量進(jìn)樣器，打孔器，玻璃板，電泳儀 方法： 1．抗體瓊脂板的制備 同單向擴散法，但注意稀釋液應(yīng)用 離子強度 的巴比妥緩沖液。 圖 6 免疫電泳抗原孔和抗體槽位置示意圖 (五 )火箭電泳試驗 火箭電泳實際是一種定量免疫電泳。 ，加入抗血清，進(jìn)行雙擴散，一般在 24小時內(nèi)沉淀弧出全。 ：用微量進(jìn)樣器往孔中加 1— 5 微升。 方法： (ⅹ 厘米 )加上 毫升 %瓊脂凝膠，制成 2 毫米厚的瓊脂板。 2．抗體：正常人血清的家兔免疫血清。每條沉淀弧線代表一組抗原抗體復(fù)合物，故可用抗原成分分析；且可以根據(jù)其遷移率與抗體所出現(xiàn)的特異反應(yīng)進(jìn)行鑒定。 (四 )免疫電泳實驗 免疫電泳實驗是先將抗原物質(zhì)在瓊脂凝膠中做電泳分離，然后于凝膠槽中加入抗體血清。但電壓過高則孔徑變形，電流過大抗原抗體蛋白易變性，干擾實驗結(jié)果。 Tris 緩沖液更差。 (2) 幾組電泳緩沖液其電泳結(jié)果以巴比妥鈉 — 鹽酸緩沖液靈敏度最高。當(dāng)抗體濃度恒定時，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時，作10 倍、 20 倍或更高倍數(shù)稀釋可以提高陽性率。如果抗原，兩極微沉淀條紋不清晰，于 37℃保溫數(shù)小時可增強沉淀條紋的清晰度。通電 45 分鐘 — 2 小時后觀察結(jié)果。要求電流量為 2— 3 毫安 /厘米，即大板為 20 毫安，小板為 10 毫安。將加好樣品的玻板置于電泳槽上，抗原端接負(fù)極，抗體端接正極，用 2— 4 層濾紙浸濕作鹽橋，濾紙與瓊脂板聯(lián)接處為 厘米。 圖 5 對流免疫電泳抗原孔、抗體孔位置示意圖 3．電泳 用國產(chǎn)普通電泳儀。大玻板約需瓊脂 10 毫升，小玻片約需 毫升，凝固后按圖打孔，方法同瓊脂擴散試驗。 6．電泳儀 7．其他：生理鹽水、打孔器、微量進(jìn)樣器。這樣抗原體就達(dá)到了定向?qū)α?，在兩者相遇且比例合適時便形成肉眼可見的沉淀線?？贵w分子就是隨著帶正電荷的液體向負(fù)極移動的。所謂電滲作用是指在電場中溶液對于一個固定固體的相對移動。所以游動慢。 血清蛋白在 ，所以在電場作用下都向 E極移動。 (三 )對流免疫電泳試驗 對流免疫電泳是在瓊 脂擴散基礎(chǔ)上結(jié)合電泳技術(shù)而建立的一種簡便而快速的方法。 ⑥時間對沉淀線的影響：沉淀線形成一般在 13 天出現(xiàn)， 1421 天出現(xiàn)的數(shù)目最多。 ⑤參加擴散的抗原與抗體間的距離對沉淀線形成的影響：抗原、抗體相距越遠(yuǎn)，沉淀線形成的越慢，所以在微量玻片法時，孔間距離以，距離遠(yuǎn)影響反應(yīng)速度。在雙向擴散時，為了減少沉淀線變形并保持其清晰度，可在 37℃下形成沉淀線，然后置于室溫或冰箱 (4℃ )中為佳。 圖 4 抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系 a、 b：抗體 A、 A’、 B：抗原 A、 B 完全不同 A、 A’部分相同 ③溫度對沉淀線的影響：在一定范圍內(nèi)，溫度擴散快。 圖 3 雙擴散試驗結(jié)果示意圖 A：已知抗體 a、 b：陽性對照 c、 d、 e、 f：被檢材料 ②抗原濃度與沉淀先導(dǎo)形狀的關(guān)系：兩相鄰抗原濃度相同，形成對稱相融合的沉淀線；如果兩 抗原濃度不同，則沉淀線不對稱，移向低濃度的一邊。反之，如相鄰抗原完全不同時，則出現(xiàn)沉淀線之交叉；兩種抗原部分相同時，則出現(xiàn)沉淀線的部分融合。 6．結(jié)果分析：瓊脂擴散結(jié)果受許多因素影響。實驗時至少要做一陽性對照。 5．結(jié)果觀察：若凝膠中抗原抗體是特異性的，則形成抗原 — 抗體復(fù)合物，在兩孔之間出現(xiàn)一清晰致密白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。加樣時勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴散結(jié)果?？椎呐帕蟹绞饺鐖D 2 所示。 方法： 1．取一清潔載玻片，傾注 — 毫升加熱熔化的 1%食鹽瓊脂制成瓊脂板。 5．測定各孔形成的沉淀環(huán)直徑 (mm),用參考血清各稀釋度測定值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出被檢血清中免疫球蛋白的含量。 圖 1 單向瓊脂擴散試驗抗原孔位置示意圖 15 孔加參考血清， 67 孔加待檢血清 3．向孔內(nèi) 滴加 1： 2， 1： 4， 1： 8， 1： 16， 1： 32 稀釋的參考血清及 1： 10 稀釋的待檢血清，每孔 10 微升，此時加入的抗原液面應(yīng)與瓊脂板一平，不得外溢。 方法： 1．將適當(dāng)稀釋 (事先滴定 )的診斷血清與予溶化的 2%瓊脂在 60℃水浴預(yù)熱數(shù)分鐘后等量混合均勻制成免疫瓊脂板。 (1) 單向瓊脂擴散試驗 材料： 1．診斷血清 (抗體：抗人 IgG或 IgA 免疫血清 ) 2．待檢血清 (抗原 )：人血清 3．參考血清：全國統(tǒng)一人血清免疫球蛋白參考血清 (批號不同，免疫球蛋白含量不同 )。如果凝膠中有多種不同抗原抗體存在時，便依各自擴散速度的差異，在適當(dāng)部位形成獨立的沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。 抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中相遇時，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線。 4. 置室溫中 10— 20 分鐘，觀察液面有無乳白色沉淀環(huán)，若有則為陽性。 2. 以毛細(xì)吸管吸取生理鹽水 毫升加入第二管。 材料： 1. 免疫血清：免疫兔抗人血清 2. 抗原：人血清 3. 小沉淀管、毛細(xì)吸管、橡皮頭、生理鹽水。此外還有放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等測定法。 為了求得抗原與抗體的適宜比例，保證有足夠的抗體，而且抗原分子小，具有較大的反應(yīng)面積，因此操作上通常是稀釋抗原，不稀釋抗體。 實驗二 沉淀反應(yīng) 可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合，在電解質(zhì)存在 的條件下，兩者比例適合，即可有沉淀物出現(xiàn)，叫沉淀反應(yīng) (Precipitation).由于沉淀反應(yīng)抗原多系膠體溶液。于劃線內(nèi)部滴加染液 34 滴，經(jīng) 35 分鐘后，再滴加等量的蒸餾水，輕輕晃動混合。 ) 2．瑞特氏染色法： 取小鼠骨動脈血，涂制玻片。貯褐色瓶中備用。常伸出短而鈍突起，有很強的吞噬能力。漿細(xì)胞合成和分泌抗體，對免疫有重要意義。核圓形，著色深，多偏于細(xì)胞的一側(cè)，染色質(zhì)核膜呈車輪分布。常成群地分布于血管的周圍。 二．肥大細(xì)胞的觀察 (示教 ) 胞體較大，呈卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大均等的嗜鹼性顆粒。核呈腎形或馬蹄形，染色略淺于淋巴細(xì)胞的核。 單核細(xì)胞：體 積最大，細(xì)胞圓形。中淋巴細(xì)胞較大，有較寬層的細(xì)胞，核圓形。其中含致密的核，染成深紫色。 (C) 無顆粒白血球 淋巴細(xì)胞：涂片中可觀察到中、小型兩種。 嗜堿性顆粒白血球：體積略小于嗜酸性白血球，細(xì)胞質(zhì)中有大小不等被染成紫色顆粒，顆粒數(shù)目較嗜酸性白血球的顆粒少，核為 1— 2 葉染成淡蘭色。 嗜酸性顆粒白血球：略大于嗜中白血球，細(xì)胞核染成紫色，通常為 2葉，胞質(zhì)充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。 (B) 顆粒白血球 嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細(xì)胞，細(xì)胞核被染成紫色分葉狀，可分 1— 5 葉，核葉之間聯(lián)以染色質(zhì)細(xì)絲，染色質(zhì)染成粉色，其中充滿細(xì)小的大小均勻的顆粒被染成紫紅色。常見的免疫學(xué)實驗技術(shù) 主要內(nèi)容： 實驗一 與免疫相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)的觀察 實驗二 沉淀反應(yīng) 實驗三 凝集反應(yīng) 實驗四 溶血反應(yīng)和補體結(jié)合試驗 實驗五 T、 B 淋巴細(xì)胞分離試驗 實驗六 豚鼠 T淋巴細(xì)胞的測定 實驗七 酶聯(lián)免疫吸附試驗 實驗八 抗原和免疫血清的制備 實驗九 血球凝集和血球凝集抑制試驗 實驗十 白細(xì)胞移動抑制試驗 實驗十一 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 實驗十二 NK 細(xì)胞活性測定 實驗十三 流式細(xì)胞儀檢測技術(shù) 實驗十四 殺傷細(xì)胞功能的檢測 實驗十五 吞噬功能試驗 附 錄 實驗一 與免疫相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)的觀察 目的要求： 觀察與免疫相關(guān)的幾種細(xì)胞的形態(tài)，了解它們在機體免疫反應(yīng)中的作用。 實驗器材： 顯微鏡 血液涂片 (瑞氏染色 ) 結(jié)締組織切片 方法： 油鏡觀察 一．血涂片的觀察 (A) 紅細(xì)胞：淡紅色，無核的圓形細(xì)胞，因紅血球為雙凹形，故邊緣部分染色較深，中心較淺，直徑 7— 8 微米。直徑 10— 12 微米。直徑 10— 15 微米。直徑 10— 11 微米。小淋巴細(xì)胞與紅血球大小相似，圓形。周圍僅有一薄層嗜鹼性染成淡藍(lán)的細(xì)胞質(zhì)。 68微米。胞質(zhì)染成灰藍(lán)色。直徑 1420 微米。其中含肝素、組織胺等物質(zhì)。 三．漿細(xì)胞的觀察 (示教 ) 細(xì)胞呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)豐富，呈嗜鹼性。正常組織漿細(xì)胞少，慢性炎癥時增多。 四．巨噬細(xì)胞：又稱組織細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。 附： 瑞特氏染色： 1．染色液配置 稱取瑞特氏染料 克溶于 60ml 甲醇中，過濾。 (配置時，要先將瑞特氏染料置研缽體內(nèi)邊研邊滴加甲醇，使染料溶液得更好。干后用玻璃筆在涂處之兩側(cè)劃線 (限制染液流掉 )。經(jīng) 5 分鐘后，用蒸餾水洗凈，待干后用油鏡檢查。沉淀物主要是由抗體蛋白所組成。 沉淀反應(yīng)的種類有環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴散及免疫電泳等。 (一 )環(huán)狀沉淀反應(yīng) 當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體形成一個接觸面時，如二者比例適當(dāng)，接觸面上可形成一個乳白色的環(huán)狀物即為陽性沉淀反應(yīng)。 方法： 1. 取小沉淀管 2 只，以毛細(xì)吸管吸取抗人血