【正文】 瑰花環(huán)試驗，又稱為花結(jié)試驗。 人類 T和 B 淋巴細(xì)胞表 面具有不同的受體。根據(jù) E— 玫瑰花環(huán)形成率，可以間接判斷機(jī)體細(xì)胞免疫力。 材料： 1. 肝素 (100 單位 /毫升 ) 2. %兔紅細(xì)胞懸液 (用 Hanks 液配制 ) 3. 吸收過的胎牛血清： 取經(jīng) 56℃ 30 分鐘加熱滅活后的胎牛血清加半量壓積兔紅細(xì)胞混合后， 37℃水浴 20 分鐘， 2020 轉(zhuǎn) /分離心 10 分鐘，取上 清液即成。 方法： 1. 淋巴細(xì)胞提取 (1) 取豚鼠抗凝血 2毫升，加 3毫升 Hanks液使之稀釋。 (2) 2020 轉(zhuǎn) /分離心 30 分鐘，吸淋巴細(xì)胞層到另一試管中加 5 倍體積的 Hanks 液洗 1— 2 次， (1500 轉(zhuǎn) /分離心 10 分鐘 )棄上清即成?；旌虾?， 37℃水浴 5 分鐘。 4. 染色及觀察 輕輕懸浮沉積的細(xì)胞。 高倍鏡或油鏡下計數(shù) 200 個淋巴細(xì)胞，凡結(jié)合 3 個或 3 個以上的兔紅細(xì)胞者為陽性，計算花環(huán)形成細(xì)胞的百分率。此法敏感性高，特異性強(qiáng)。本次試驗介紹，酶聯(lián)葡萄球菌蛋白 A 免疫分析法。經(jīng)酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物。 10. 終止液； 2M 硫酸 方法： 1．抗原包被 取潔凈的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，于每孔內(nèi)加傷寒抗原 毫升 (用包被緩沖液稀釋，蛋白含量 10 微克 /毫升 )，置 37℃ 1 小時，棄抗原液，用洗滌液 3 次每次 3 分鐘。置37℃ 30 分鐘，洗滌 3 次。 4．加臨時配制的底物溶液各 毫升，置暗處 15 分鐘。 ： (肉眼判斷 ) 若顏色于陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據(jù)顏色深淺以 (+)表示。計算溶血空斑數(shù)目，則可推算脾內(nèi)存在的抗體產(chǎn)生細(xì)胞總數(shù)。 6. 的 Hanks 液，凡士林油。 (2)取出脾臟研缽中研碎，加 Hanks 液 2— 3 毫升，用吸管反復(fù)吹打數(shù)次 ，使細(xì)胞分散。 如細(xì)胞太多，可加蒸餾水 4 毫升迅速混勻，半分鐘后立即加入等量Hanks 液混勻 1000 轉(zhuǎn) /分離心 10 分鐘，棄上清。用乳頭吸管吹打使沉淀細(xì)胞懸起混勻，此即為 50 倍稀釋的脾細(xì)胞。 *脾細(xì)胞懸液制備過程中應(yīng)在冰水浴中進(jìn)行。用鑷子尾端將蓋片壓平貼牢 (保持小室一定體積 )。 圖 10 玻片小室示意圖 4．細(xì)胞混合液的配制 取小試管一只，用 1毫升吸管吸取 毫升指示細(xì)胞懸液，用另一吸管吸取 毫升 500 倍稀釋的脾細(xì)胞懸液，混勻即為被檢的細(xì)胞混合懸液。 6．用牙簽粘取少許凡士林益封小室開口。對模糊不清的空斑可在低倍鏡下檢查，真正的溶血空斑必須中心有一個淋巴細(xì)胞，周圍為透明區(qū)。在免疫學(xué)實踐，為制備抗體常以抗原性物質(zhì) (細(xì)菌、病毒、類毒素、血清及其他蛋白質(zhì) )給動物注射。這種含有特異性抗體的血清稱為免疫血清。 抗體的產(chǎn)生通常與抗原的質(zhì)和量、動物種類以及接種途徑有密切關(guān)系。 一． 抗菌血清的制備 材料： 1. 動物：家兔 2. 菌種：傷寒桿菌 H901，傷寒桿菌 O901 3. 培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基 4. 其它： %甲醛鹽水， %石灰酸鹽水，無菌生理鹽水，標(biāo)準(zhǔn)比濁管，離心機(jī)。在生理鹽水中不發(fā)生自身凝集，與特異血清有高度凝集者可作為菌種。肉眼觀察有無雜菌生長，必要時作鏡檢。得到原液。 O 菌液的制備：將合格的傷寒桿菌 H 菌株依上法培養(yǎng)后，用無菌 %石灰酸鹽水將菌苔洗下，洗液裝入無菌試管置于 37℃溫箱中 18— 24小時殺菌得原液。即用 %石灰酸生理鹽水洗下 H 菌菌液置100℃水浴 60 分鐘，破壞其 H 抗原即為 O 菌液。是為了應(yīng)用液加入適量甲醛使其為 %，制備好的原液及應(yīng)用液均保存在 2— 10℃冰箱中備用，有效期為 1 年。 管號 12345678910 1%BaCl2(ml). 1%H2SO4(ml) 相當(dāng)菌數(shù) (億 /ml)36912151821242730 (3) 將洗下的細(xì)菌原液放入與比濁管相同的試管中并予以一定稀釋。如細(xì)菌原液 1： 5 稀釋后其濁度與第 3 管相當(dāng)，則原液每毫升含菌數(shù)為 9ⅹ 5=45 億。 3．免疫方法 (1) 選擇體重 2— 3 千克的健康雄兔 2— 3 只，由耳靜脈采血 1毫升，分離血清。如無或微量時，該動物可用于免疫。 日期第 1 天第 5 天第 10 天第 15 天第 20 天 注射劑量 (3) 末次注射后 7 天耳靜脈采血 1 毫升，分離血清。若效價不高可再增量注射菌液 1— 2 次，再行試血。分離血清，加入防腐劑 (如萬分之一的硫化汞 )放 4℃保存?zhèn)溆?。加?2— 3 倍的生理鹽水并用毛細(xì)滴管反復(fù)吹打混勻，離心沉淀 5 分鐘，吸去上清液。直至上清液透明無色再吸去上清夜，留密集血球備用。 (3) 用生理鹽水將紅血球配成需要濃度，即為試驗用的血球懸液。 3. 免疫方法 (1) 選擇 2— 3 千克健康雄兔，按如下劑量及程序免疫： 日期劑量 (毫升 )途徑 第 1 天全血 皮內(nèi) 第 3 天全血 皮內(nèi) 第 5 天全血 皮內(nèi) 第 7 天全血 皮內(nèi) 第 9 天全血 皮內(nèi) 第 12 天 20%紅細(xì)胞懸液全血 靜脈 第 15 天 20%紅細(xì)胞懸液全血 .0 靜脈 (2) 末次注入后 7 天，耳靜脈采血 1 毫升，滴定血液單位達(dá) 1：2020 以上可頸動脈放血，分離血清，放等量甘油防腐，分裝無菌安瓶，貯于 4℃中備用。 4．其它：無菌生理鹽水，無菌研缽等。 2．人血清 —— 弗氏完全的制備 將滅菌佐劑一份置研缽中，邊研磨邊滴加等量的含卡介苗 3— 4 毫克 /毫升的抗原液，使成油色水乳劑，研磨要充分，使乳劑滴入冰水中不擴(kuò)散。 四．菌脂多糖的制備 脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，所以抗脂多糖抗體的制備可用革蘭氏陰性細(xì)菌菌體抗原來制備，因此這里只介紹幾種細(xì)菌脂多糖提取的方法。近年來發(fā)現(xiàn)在酸層中也含糖類。 方法： 1. 細(xì)菌濃懸液用 鹽水經(jīng) 2500 轉(zhuǎn) /分， 20 分鐘離心洗滌一次。將兩次提的水溶液混合，置透析袋中于生理鹽水中透析 2 天， 其間換幾次鹽水，以除去酚。即成粗制脂多糖，于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩? 2. 用超聲波發(fā)生器中頻 (約相當(dāng)于 12020cps)處理 20 分鐘。置 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ帽潇o置兩星期以上(使菌體殘渣自由下沉 )。 選做實驗 實驗一機(jī)體的天然免疫機(jī)制 目的要求： 觀察機(jī)體的非特異免疫現(xiàn)象；加深理解機(jī)體的天然免疫機(jī)制。這種天然獲得的免疫性首先表現(xiàn)在種的免疫上，如不同種動物對某些感染具有先天的抵抗力。如皮膚與黏膜是抵抗外來侵 害的第一道屏障。正好血清中也含有許多殺菌的因素，如補(bǔ)體。血液中的白血球及巨噬細(xì)胞對外來異物有吞噬及消化的作用，這種作用也是天然防御中的重要機(jī)制之一。 2．用 吸管取新鮮無菌兔血清 毫升，加入第 1 管內(nèi)。 4．再用吸管吸取傷寒桿菌培養(yǎng)液，分別加入 1及 2 管中各 毫升。然后振蕩兩支試管使之均勻混合，置 37℃水浴箱中。 3039。對照 (如圖 )。部分，再將試 管放回水浴箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 2 號試管只于作用 60 分鐘取出，采一接種環(huán)菌劃線接種于培養(yǎng)基的對照部分。觀察各試驗部分及對照部分生長的細(xì)菌菌落數(shù)目。 二．溶菌酶的殺菌作用 唾液溶菌酶試驗 唾液里含有溶菌酶，能溶解革蘭氏陽性菌，是機(jī)體非特異性免疫因素之一。測定體液中溶菌酶含量的變化，認(rèn)為可以反映非特異性免疫功能一個方面。 2．唾液流入無菌平皿內(nèi)，以備用。將兩支小試管放 37℃水浴箱保溫 30 分鐘。 方法： 1． 試驗前 3— 6 小時。 2．將 1ml 甲型鏈球菌菌液注入小白鼠腹腔。經(jīng) 5ˊ、 10ˊ、 20ˊ、 40ˊ后，分 別取腹腔液滴于玻片上制成涂片，經(jīng)自然干燥后，用稀釋的美藍(lán)液染色一分鐘后鏡檢。 結(jié)果觀察： 細(xì)菌及細(xì)胞核呈深蘭色，細(xì)胞漿呈淡蘭色，在不同時間的涂片中，可看到處于不同階段的吞噬現(xiàn)象。 方法： 1． 48～ 72 小時以前無菌漿糊 1ml 注入小白鼠腹腔內(nèi)。 3．血球注入后經(jīng) 30 分鐘至 1 小時后，用毛細(xì)管取腹腔液制成涂片，待干后用瑞氏染液染色鏡檢。 結(jié)果觀察： 雞紅細(xì)胞呈橢圓，有細(xì)胞核，經(jīng)染色后胞漿呈粉紅色，核呈紫藍(lán)色。 附：小白鼠腹腔注射法 1. 用消毒好的注射器，按無菌操作法抽菌懸液后，再用無菌鑷子夾一滅菌棉花包，將針頭刺入棉花包內(nèi)，排出注射器內(nèi)的氣泡，然后將注射器平擔(dān)于試管架上。 3. 以無菌鑷子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用鑷子取去注射器針頭上的棉花包放入消毒罐中。注入菌液 1 毫升后將針頭退出。如用復(fù)紅 (紅色 )，美藍(lán) (蘭色 )放入動物罐中 。 溶血百分?jǐn)?shù) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 補(bǔ)體量 圖 12 由溶血素致敏洋紅細(xì)胞的溶血程度與腸鼠血清 (補(bǔ)體 )量增加之間的關(guān)系 以補(bǔ)體量作為橫坐標(biāo)，溶血百分?jǐn)?shù)作為縱坐標(biāo)，可得到 一個清晰的“ S”形曲線。因此當(dāng)補(bǔ)體用量稍有變動，就可對溶血程度發(fā)生很大影響。 50%溶血試驗定血清中補(bǔ)體含量用以下公式表示： 該公式可以從 Von Krogh 方程式進(jìn)一步加以論證： 假定 X=加入的新鮮血清量 y=溶血的百分率，以小數(shù)表示 V=斜率 k=常數(shù) 轉(zhuǎn)變成對數(shù)，上述公式就變成 當(dāng)以 50％溶血作為終點時，代入上述公式，由于－ log1＝ 0，也即表示補(bǔ)體的 50％溶血單位就是加入的新鮮血清量。經(jīng)高壓滅菌后即可使用。 2．綿羊紅細(xì)胞懸液 (1 10g/ml) 3．溶血素 (2U) 4．被檢血清 (新鮮豚鼠血清 ) 5．水平離心機(jī) 6．水浴箱 7． 721 型分光光度計 方法： 1．濃度為 1 10g/ml 的綿羊紅細(xì)胞配制 取經(jīng)稀釋洗滌后的綿羊紅細(xì)胞配成較 5%稍濃的細(xì)胞懸液。按下式求出于一定體積的 5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋液的毫升數(shù)。 ２．致敏綿羊細(xì)胞 取綿羊紅細(xì)胞懸液 (1 10２／ ml)加等量的溶血素 (２ U／ｍｌ )。置 37℃水浴中作用３０分鐘，每隔 10 分鐘搖動一次以免細(xì)胞下降即成 5 10８／ ml 致敏羊紅細(xì)胞。置 37℃水浴中６０分鐘 (搖動１～２次，以免紅細(xì)胞下沉。 ?測定各管上清液ＯＤ值 (波長＝５４０ｎｍ ) ４．補(bǔ)體ＣＨ５０單位的計算 從測定管 (第１～５管 )及溶血對照管 (第６管 )的ＯＤ值中減去紅細(xì)胞對照管 (第７管的ＯＤ值。即為測定管的校正ＯＤ值。 在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上，以ｙ／ (１─ y)值為橫坐標(biāo)，血清用量為縱坐標(biāo)，得到一條直線。即可由橫坐標(biāo)等于 1 的一點，在直線上求得在縱坐標(biāo)上相應(yīng)的截距，此即產(chǎn)生50%溶血的待測血清實際用量。 實驗九 血球凝集和血球凝集抑制試驗 病毒的血清學(xué)反應(yīng)與其他微生物的血清學(xué)反應(yīng)相同，即可已知抗原測未知抗體或用已知抗體測未知抗原。 病 毒導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集的原因還不十分清楚，但對流感病毒的血凝一般解釋為病毒包膜上的血凝素，作用于紅細(xì)胞表面的受體而產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。其中以雞、豚鼠、人的紅細(xì)胞應(yīng)用得最多。 材料： 1. 新城雞瘟病毒 2. %雞紅細(xì)胞 3. 抗雞瘟病毒血清 4. 生理鹽水、大孔塑料板、小孔塑料板 5. 稀釋棒： (用于血凝 )， (用于血凝抑制 ) 6. 定量滴頭： 1ml 注射器上加 16 號針頭，經(jīng)其口滴出液體 1 滴相當(dāng)于 。凡出現(xiàn)凝集者，血球沉于孔底呈平鋪象倒張的傘狀，邊緣有卷起的趨向。 各孔凝集結(jié)果以 +++， ++， +， 表示 ++++全部血球凝集，一層紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，呈顆粒狀薄膜，邊緣不整齊。 ++約有 50%血球凝集，血球在孔底形成環(huán)狀，四周有小凝集塊。 不凝集，血球沉于孔底中心，呈一致密的圓點，光滑圓潤。若血凝單位為 1： 320，故抗原稀釋度應(yīng)為 1： 80，由于試驗時用量為 毫升，故含 4 單位應(yīng)為 1： 40。 三．微量血凝及血抑試驗 方法： 1. 滴定血凝效價：先用定量滴頭按下表，第 1 孔加 8 滴，其余每孔加 2 滴，然后用大號螺旋圈吸滿病毒液順次稀釋至第 10 孔。下表內(nèi)的單位為滴數(shù)。 3. 血凝抑制試驗：將試驗血清按下表稀釋，首先按表滴數(shù)加生理鹽水，然后加入第 第 2 及第 3 孔以試驗血清，用小號螺旋圈順次