【正文】 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作方法](一) 豚鼠淋巴細(xì)胞的制備1. 方法1取豚鼠肝素抗凝血3 ml，沿離心管壁輕輕地加入到 3 ml 的淋巴細(xì)胞分層液的上面，使二層液體的界面不相混合；于水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)中，2000r/min離心20min，離心后分為四層，上層為血漿，此層與分層液液面交界處有一云霧狀層，即為淋巴細(xì)胞層，云霧狀層之下為淋巴細(xì)胞分層液，底層主要為紅細(xì)胞，用毛細(xì)管輕輕地把淋巴細(xì)胞層吸入另一試管中；用5倍Hank’s 液反復(fù)洗滌淋巴細(xì)胞2次，每次2000r/min 離心10min；若第一次離心后，沉淀的淋巴細(xì)胞中有少量紅細(xì)胞，可加蒸餾水l ml 左右，振搖1min，使紅細(xì)胞破裂，然后立即加Hank’s液4 ml 左右，混勻，2000r/min 離心10min，棄上清液，繼續(xù)用Hank’s液洗滌一次；沉淀的淋巴細(xì)胞用Hank’s液配成細(xì)胞數(shù)為5106個(gè)/ml的懸液。[材料與試劑]1. 試管，離心管，毛細(xì)管，吸管，注射器，載玻片，血球計(jì)數(shù)板，豚鼠，家兔等。凡能與紅細(xì)胞形成E玫瑰花環(huán)的淋巴細(xì)胞簡稱為E花環(huán)形成細(xì)胞。附 錄1. 阿氏液（Alsever）：即紅細(xì)胞保養(yǎng)液枸櫞酸鈉（5H2O） 枸櫞酸（H2O） 葡萄糖 氯化鈉 雙蒸水 加至 100 ml 將以上試劑加熱溶解于雙蒸水中，115℃滅菌10min,4℃保存?zhèn)溆?。?2 病毒血凝抑制試驗(yàn)的操作方法（單位：mL）孔 號(hào)123456789101112血清稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒對(duì)照血清對(duì)照生理鹽水5050505050505050505050被檢雞血清50505050505050505050504單位病毒505050505050505050505050室溫中靜置 10 min%紅細(xì)胞505050505050505050505050棄去50 結(jié)果觀察++++++++++++++6. 結(jié)果判定：待病毒對(duì)照孔（第11孔）出現(xiàn)紅細(xì)胞100%凝集（++++），而血清對(duì)照孔（第12孔）為完全不凝集（）時(shí)，即可進(jìn)行結(jié)果觀察。2. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清的方法，自第1孔至第11孔各加50mL生理鹽水。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100% 凝集（++++），不凝集者（）紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作方法]（一）血球凝集(HA)試驗(yàn) 1. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50mL生理鹽水。 [目的要求]掌握病毒HA和HI試驗(yàn)的原理和基本操作方法，了解其實(shí)用價(jià)值。若液體呈混濁或放置后管底有紅細(xì)胞沉淀為不溶血。3. 補(bǔ)體的制備：將新鮮豚鼠血清（補(bǔ)體）用生理鹽水稀釋成1:20，取1 ml 置56℃水浴30min滅活。[材料與試劑]1. 試管，試管架，可調(diào)加樣器，滴頭，滴管，注射器，針頭等。補(bǔ)體（Complement）是存在于正常人和脊椎動(dòng)物血清及組織液中一組具有酶原活性的蛋白質(zhì)，以豚鼠血清中的補(bǔ)體成分較全且活性高。如沉淀線不清晰，可將瓊脂凝膠板放在濕盒中37℃數(shù)小時(shí)或置電泳槽過夜再觀察。將抗原孔置于負(fù)極端。1. 瓊脂板制備：用巴比妥緩沖液配制1%% 瓊脂凝膠板，厚度23mm。（三）對(duì)流免疫電泳，抗體球蛋白帶有微弱的負(fù)電荷，在電泳時(shí)，由于電滲作用的影響，抗體球蛋白反而向負(fù)極倒退。待檢血清無沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對(duì)照的沉淀帶完全交叉者判為陰性。（3）抗原檢測(cè)：將兔抗豬IgG（抗血清）加入中心孔，將待測(cè)抗原（豬血清、雞血清、兔血清、牛血清、羊血清等）置于周圍孔中。4. 加樣：以毛細(xì)滴管（或加樣器）將樣品加入孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。待溶解的瓊脂溫度降至60℃左右時(shí)倒入平皿中，厚度為23mm。絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在200ku以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，所受阻力甚小。4. 注意：觀察結(jié)果時(shí)，可將一只手放在小試管對(duì)測(cè)的適當(dāng)位置上遮擋光線，有利于看到白色沉淀環(huán)。取其1支，用毛細(xì)滴管將待檢抗原沿著管壁輕輕加入使重疊在炭疽沉淀素血清之上，上下兩液間有一整齊的界面，注意勿產(chǎn)生氣泡。(2) 如待檢材料是皮張、獸毛等，可采用冷浸法。[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作方法] （一）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(Ring precipitation test)是最早的沉淀反應(yīng)。2. 生理鹽水，% NaCl溶液，% 石炭酸生理鹽水，巴比妥緩沖液，瓊脂粉等。[目的要求]1. 掌握炭疽環(huán)狀沉淀試驗(yàn)的操作方法和結(jié)果觀察。2. 結(jié)果判定：在室溫（20℃）下，觀察3060s，凝集者為陽性，不凝集者為陰性。同時(shí)以陽、陰性血清作對(duì)照?？乖遣际蠗U菌加虎紅制成。6. 平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)的關(guān)系見表12。＋＋＋：有明顯凝集塊，液體幾乎完全透明，即75% 凝集。3. 作用：混和完畢后，將玻板置恒溫箱中或采用別的辦法適當(dāng)加溫，使溫度達(dá)到30℃左右，35min內(nèi)記錄反應(yīng)結(jié)果。大規(guī)模檢疫時(shí)，允許只用兩個(gè)血清量作試驗(yàn)，牛、馬、駱駝?dòng)?0mL 和20mL ；豬、山羊、綿羊、狗用80mL和40mL。對(duì)同群中既無臨床癥狀又無凝集反應(yīng)陽性者，馬、豬重檢仍為可疑，判陰性；牛、羊重檢仍為可疑者，可判為陽性，或以補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)核對(duì)。牛、馬和駱駝的血清凝集價(jià)大于或等于1:100，判為陽性，1:50的凝集價(jià)判為疑似反應(yīng)（可疑）；豬、綿羊、山羊和狗的血清凝集價(jià)大于或等于1:50，判為陽性，1:25的凝集價(jià)判為疑似反應(yīng)（可疑）。＋＋：50％抗原凝集，上清液渾濁半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明顯的凝集）。根據(jù)各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集塊的形狀，來判定凝集反應(yīng)的程度。3. 對(duì)照管制作：% ml ，第6管加1: ml ，第7管加1: ml 。1. 試管準(zhǔn)備：每份血清用試管4支，另取3支試管作為對(duì)照，作好標(biāo)記，置試管架上。2. 滅菌的生理鹽水，%石炭酸生理鹽水。[目的要求]1. 掌握平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)的操作方法。細(xì)菌或其它凝集原都帶有相同的負(fù)電荷，在懸液中相互排斥而呈現(xiàn)均勻的分散狀態(tài)。參與凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原（Agglutinogen），抗體稱為凝集素（Agglutinin）。凝集反應(yīng)包括直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類，本實(shí)驗(yàn)主要介紹直接凝集反應(yīng)。[材料與試劑]1. 玻板，載玻片，試管（1cm x 8cm），試管架，刻度吸管，滴管，微量可調(diào)加樣器，滴頭（tip頭），牙簽或火柴棒，記號(hào)筆。[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作方法]（一）試管凝集試驗(yàn)以牛布氏桿菌病試管凝集試驗(yàn)為例。該被檢血清的稀釋度分別是1:、1:21:50、1:100。6. 結(jié)果判定：判定結(jié)果時(shí)用“+”表示反應(yīng)的強(qiáng)度。（管底凝集物與100%凝集時(shí)相同，只是上清液稍渾濁）。7. 判定標(biāo)準(zhǔn)：能使50% 抗原凝集的血清最高稀釋度稱為該血清的凝集價(jià)（或稱滴度）。陽性畜群，重檢時(shí)仍為可疑，可判為陽性。每一份檢樣需換一個(gè)tip頭?？乖们皳u勻，并置室溫使其溫度達(dá)20℃左右。＋＋＋＋：出現(xiàn)大的凝集塊，液體完全透明，即100% 凝集。－：液體均勻混濁，無凝集現(xiàn)象。（三）虎紅平板凝集試驗(yàn)這種試驗(yàn)是快速平板凝集試驗(yàn)。在室溫（20℃）410min內(nèi)記錄反應(yīng)結(jié)果。（四）雞白痢平板凝集試驗(yàn)1. 被檢雞血清和雞白痢平板凝集抗原各1滴（約30mL）滴于玻板或載玻片上，用牙簽或火柴棒充分混合。沉淀反應(yīng)主要包括有環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)及免疫電泳等。[材料與試劑]1. ，毛細(xì)滴管，載玻片，平皿，燒杯沒，打孔器，針頭，酒精燈，加樣器（移液器），滴頭，電泳槽，電泳儀等。5. 小鵝瘟瓊擴(kuò)抗原，小鵝瘟抗血清；雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)抗原（或待檢法氏囊組織浸提液），雞傳染性法氏囊病陽性血清。1. 待檢抗原的制備(1) 取疑為炭疽死亡動(dòng)物的實(shí)質(zhì)臟器1g放入小燒杯中剪碎，加生理鹽水510ml，煮沸30min，冷卻后用濾紙過濾使之呈清澈透明的液體，即為待檢抗原。2. 加樣：， ml 的炭疽沉淀素血清(用毛細(xì)滴管加，注意液面勿有氣泡)。對(duì)照組中，加炭疽沉淀抗原者應(yīng)出現(xiàn)白環(huán)，而加生理鹽水者應(yīng)不出現(xiàn)白環(huán)。1% 瓊脂凝膠形成網(wǎng)狀構(gòu)架，空隙中是98%99% 的水，允許分子量在200ku以下分子通過。1. 瓊脂板制備：稱取1g瓊脂粉，加入100ml % NaCl溶液（禽類），煮沸使之溶解。3. 封底：在火焰上緩緩加熱，使孔底瓊脂凝膠微微融化，以防止孔底邊緣滲漏?；蛘呤菍⑿※Z