【正文】 ）多用作定性試驗(yàn)。出現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。也常用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定。方法步驟（以鑒定待測標(biāo)本中的細(xì)菌為例） 取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分為左右2格。 用接種環(huán)取標(biāo)準(zhǔn)菌液少許于左格生理鹽水中混勻， 滅菌接種環(huán)，同樣方法取待檢菌液少許于右格診斷血清并混勻。在診斷血清中，細(xì)菌與相應(yīng)抗體反應(yīng)會出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，為陽性結(jié)果?！咀⒁馐马?xiàng)】 1．每一待檢菌均需作生理鹽水對照，以排除當(dāng)細(xì)菌發(fā)生S－R變異時(shí)的細(xì)菌自凝，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。5．嚴(yán)格無菌操作。在試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和pH不適當(dāng)?shù)仍?，可引起抗原的非特異性凝集，出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對照組。在輸血時(shí)也常用于受體和供體兩者的紅細(xì)胞和血清的交互配血試驗(yàn)。這種反應(yīng)適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測，其敏感度高于沉淀反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。間接血凝試驗(yàn)（indirect hem agglutination test）是將可溶性抗原（細(xì)菌的提取液等）吸附于紅細(xì)胞成為抗原致敏紅細(xì)胞，這種“致敏紅細(xì)胞”與相應(yīng)抗體作用可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象（圖2－1）。3． 2%綿羊紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、試管、吸管、37℃水浴箱。5． 致敏紅細(xì)胞懸液制備： 取一定稀釋度的抗原（應(yīng)事先滴定）加等量2%綿羊紅細(xì)胞懸液，混合后放入37℃水浴箱中，每隔15min取出振搖1次，共經(jīng)2h，然后取出，用生理鹽水洗滌3次，%懸液即成。2． ，加入第1管。如此依次稀釋到第9管。4． %綿羊紅細(xì)胞懸液，混勻后放入37℃水浴中2h觀察結(jié)果。如紅細(xì)胞凝集，則分布于管底周圍。 －：紅細(xì)胞沉積于管底；＋：紅細(xì)胞沉積于管底，周圍有散在少量凝集；＋＋：紅細(xì)胞形成層凝集，面積較小，邊緣較松散；＋＋＋：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積略多于＋＋；＋＋＋＋：紅細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀呈現(xiàn)明顯血凝（＋＋）試管中免疫血清的最高稀釋倍數(shù)，即為該血清的間接血凝效價(jià)。常用于檢查HBsAg、甲胎蛋白、新型隱球莢膜抗原等可溶性抗原。2．配制致敏紅細(xì)胞懸液：于每瓶凍干診斷紅細(xì)胞加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻紅細(xì)胞懸液，%?！痉椒ú襟E】（試驗(yàn)加樣程序見表2—1）1．在“V”型血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液（）。另設(shè)第9孔為陽性對照。依照表2－14．將血凝板置于微型振蕩器上振蕩1—2min，置37℃1h后觀察結(jié)果。明顯凝集（++）：紅細(xì)胞于孔底形成簿膜狀凝集，中央可見疏松的紅點(diǎn)。中和試驗(yàn)： 在血凝板上每份標(biāo)本設(shè)測定排與對照排，每排8孔，用2只稀釋棒蘸取被檢血清，分別在第2排作倍比稀釋至第7孔，第8孔不含血清，為紅細(xì)胞對照。1～2min后，血凝板置37℃30min?！咀⒁馐马?xiàng)】1．致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短，且易變脆、溶血和污染，所以配制的致敏紅細(xì)胞懸液一般在當(dāng)天用完，若置2～10℃，使用期不超過3d。常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。2．試驗(yàn)用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。4．致敏用的抗原或抗體要求純度高，并保持良好的免疫活性。本次實(shí)驗(yàn)以臨床上常用的檢測絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠試驗(yàn)（preg nancy testing）為例?！酒鞑脑噭?．HCG致敏乳膠試劑 妊娠診斷試劑（有商品出售）。3．孕婦尿液、正常人尿液、待測尿液均可臨床篩選獲得?！痉椒ú襟E】在黑色方格反應(yīng)板上取3 個(gè)格，用毛細(xì)滴管分別加待測尿液，、孕婦尿液、正常人尿液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，分別用牙簽混勻后連續(xù)搖動1～2min?！窘Y(jié)果分析】 如試驗(yàn)格出現(xiàn)明顯凝集為陰性反應(yīng)，即HCG陰性；不出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，即HCG陽性。放置時(shí)間不應(yīng)過長，一般不超過5min。測定HCG時(shí)最好取晨尿，待測標(biāo)本如試劑的加入順序應(yīng)遵守規(guī)定的步驟，否則無法判斷結(jié)果。當(dāng)SPA與IgG相應(yīng)結(jié)合后有抗體活性的Fab段暴露于SPA菌表面，此時(shí)若有與該IgG相應(yīng)的特異性抗原存在時(shí)，則可發(fā)生凝集反應(yīng)，即為金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)（staphylococcal protein A co agglutination test）（圖2—5）。圖2－5 協(xié)同凝集試驗(yàn)原理示意圖 【器材試劑】流行腦膜炎病人腦脊液（用前經(jīng)煮沸處理2min，并適當(dāng)稀釋）。SPA菌穩(wěn)定液。用少量PBS洗下菌苔，以3000r/min離心30min，其沉淀物用PBS洗2次，%，置室溫作用6h或過夜?？贵w標(biāo)記SPA菌的制備 將SPA菌穩(wěn)定液用PBS洗1次后，再用PBS制成2%的懸液，用PBS將免疫血清稀釋成適宜濃度，一般可將測定合適的稀釋度減少半倍（如適宜濃度為1:8，則實(shí)際應(yīng)用為1:6）。取出混合液后，以3000r/min離心30min，棄上清，其沉淀物用PBS洗2次，%～%NaN3，制成2%懸液，放4℃冰箱保存?zhèn)溆?，一般可保?個(gè)月左右，其敏感性不變。2．然后第1格及第3格各加1滴病人腦脊液，第2格加1滴生理鹽水。分析各格反應(yīng)有何不同，并作出判斷?！咀⒁馐马?xiàng)】 用前仔細(xì)檢查試劑本身有無自凝顆粒。實(shí)驗(yàn)原理可溶性抗原（如血清、細(xì)菌浸出液、毒素等）和相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下可發(fā)生結(jié)合，經(jīng)過一定的時(shí)間，在二者比例適當(dāng)時(shí)形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（precipitation）。【器材試劑】1．標(biāo)本 人待檢血清 2．試劑 稀釋雞血清、抗人血清、生理鹽水 3．器材 沉淀小管（~3mm）或小試管、毛細(xì)吸管、試管架等 【方法步驟】 1．取3支沉淀小管，排列于試管架并作好標(biāo)記； 2．在1號； 3．再在1號； 4．室溫靜置10分鐘，觀察結(jié)果。2．由于沉淀反應(yīng)抗原多系膠體溶液，沉淀物主要是由抗體蛋白所組成，為求得抗原與抗體的適宜比例，故操作中通常是稀釋抗原而不稀釋抗體，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)?！咀⒁馐马?xiàng)】1．加抗原時(shí)應(yīng)使沉淀管傾斜，使其緩慢由管壁流下，輕浮于抗體上面，勿使相混，避免氣泡產(chǎn)生。 二 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 【目的要求】要求掌握試驗(yàn)原理、結(jié)果分析，熟悉其方法步驟。當(dāng)二者相遇時(shí)發(fā)生特異性反應(yīng)，在濃度比例合適處形成可見的白色沉淀線。 【器材試劑】1．標(biāo)本 待檢人血清、陽性對照血清。 3．器材 載玻片、吸管、打孔器、濕盒、微量加樣器等。2．打孔 待瓊脂凝固后，用直徑3mm的打孔器打孔，使孔間距為4 ~ 5mm。3．加樣 用微量加樣器向中央孔加入抗體（羊抗人IgG診斷血清），周圍孔加入待測抗原，其中第4孔加入陽性對照血清，第6孔分別加入不同的待檢血清。如進(jìn)行抗體效價(jià)滴定時(shí)，則在中央孔加入抗原，四周孔加入不同稀釋的抗血清?！窘Y(jié)果分析】1．如果凝膠中出現(xiàn)白色沉淀線，說明抗原與抗體相對應(yīng)。沉淀線的位置因抗原和抗體的分子量、濃度比例、擴(kuò)散速度等因素不同而異。2．在梅花孔型中，若相臨兩條沉淀線完全融合，說明兩抗原部分相同；若相臨沉淀線發(fā)生交叉，說明兩抗原完全相同。放置過久可使沉淀線消失?！咀⒁馐马?xiàng)】1．所用載玻片要潔凈、邊緣無破損，否則難以澆制瓊脂板。3．澆制瓊脂板時(shí)動作要迅速，過于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補(bǔ)或?qū)傊逶诨鹧娓咛巵砘赝ㄟ^幾次補(bǔ)底。 三 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 【目的要】求要求掌握試驗(yàn)原理、熟悉試驗(yàn)方法及結(jié)果分析，了解其臨床意義。沉淀環(huán)直徑的大小與孔中抗原濃度成正比。 【器材試劑】1．標(biāo)本 待檢人血清、免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)（IgG含量10mg/ml）。3．器材 三角燒瓶、載玻片、打孔器、吸管、滴管、濕盒、水浴箱、微量加樣器和半對數(shù)坐標(biāo)紙等。如果羊抗人IgG診斷血清的單擴(kuò)效價(jià)不是1∶60，試驗(yàn)時(shí)所需瓊脂量與抗體量的比例應(yīng)加以調(diào)整。3．打孔 待瓊脂凝固后，用打孔器打孔，孔距10~12mm。如有脫離應(yīng)注意補(bǔ)底。如同時(shí)測定多個(gè)標(biāo)本，注意做好標(biāo)記，認(rèn)真記錄，不要搞混。5．?dāng)U散 將加樣完畢的瓊脂放于濕盒中，置室溫或37℃ 24h后觀察結(jié)果。【結(jié)果分析】1．精確測量各試驗(yàn)孔沉淀環(huán)直徑，如果沉淀環(huán)不太圓，則取最大直徑和最小直徑的平均值。2．瓊脂單擴(kuò)散試驗(yàn)為定量測定法，常用于血清中IgG、IgA、IgM、補(bǔ)體、白蛋白、蛋白酶等物質(zhì)的定量測定，為臨床診斷提供參考指標(biāo)?！咀⒁馐马?xiàng)】1．澆制瓊脂板的事項(xiàng)同凝膠雙擴(kuò)散試驗(yàn)。即檢測待檢血清所用瓊脂板應(yīng)和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的瓊脂板為同一批瓊脂板。 四 對流免疫電泳 【目的要求】本實(shí)驗(yàn)以測定血清中AFP為例，要求掌握實(shí)驗(yàn)原理、熟悉操作過程和結(jié)果分析；了解臨床應(yīng)用及意義。在偏堿性的緩沖液環(huán)境和適當(dāng)?shù)闹绷麟妶鲋校蟛糠挚乖瓗в休^多的負(fù)電荷，電泳力大于電滲力，向正極移動；而抗體（尤其是IgG）在同樣的環(huán)境中帶負(fù)電荷較少，而且其分子量又較大，加上凝膠內(nèi)較強(qiáng)的電滲作用，故抗體電泳力小于電滲力，向負(fù)極移動?！酒鞑脑噭?．標(biāo)本 待測人血清、陽性對照血清。3．器材 電泳槽、電泳儀、孔型模板、打孔器、載玻片、吸管、微量加樣器、吸球、濾紙或紗布條等。 2．打孔 待瓊脂凝固后成對打孔，孔徑為3mm，孔距為5mm。4．電泳 將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，抗原孔置陰極端，抗體孔置陽極端，液面至槽高2/3處，瓊脂板兩端用濾紙條或紗布條與緩沖液相連。電泳30~90min后切斷電源，取出瓊脂板觀察結(jié)果。2．陽性結(jié)果的沉淀線位置與抗原和抗體分子的電荷情況有關(guān)，也與抗原和抗體的濃度比例有一定關(guān)系。制作瓊脂板時(shí)必須選擇高電滲作用的普通瓊脂，還要選擇高特異性、高親和力的抗體，否則結(jié)果難以解釋。但分辯率較差，當(dāng)有多種抗原抗體系統(tǒng)存在時(shí)，形成的沉淀線常形成重疊，難以分辯清楚，所以用作此目的時(shí)，反倒不如瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)。2．搭橋時(shí)應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會使電流不均勻，致使沉淀線歪斜、不均勻。4．電泳時(shí)間和電流強(qiáng)度及孔間距有關(guān)，電泳時(shí)電流不可太大，以免蛋白質(zhì)變性，孔間距如果較大應(yīng)適當(dāng)延長電泳時(shí)間。6．抗體或抗原要根據(jù)所標(biāo)效價(jià)做適當(dāng)稀釋，多做幾個(gè)稀釋度，選擇最適的比例關(guān)系。實(shí)驗(yàn)原理將凝膠單擴(kuò)散的瓊脂板置人直流電場，板孔中的抗原因帶有負(fù)電荷會在含有抗體的離子瓊脂中向正極泳動，并于比例合適處與抗體發(fā)生反應(yīng)，在泳道上形成可見的沉淀帶。整個(gè)沉淀帶的形狀呈火箭樣，故名火箭電泳。將沉淀峰與事先用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出標(biāo)本中抗原的含量。 2．試劑 抗AFP抗體、 ／L巴比妥緩沖液、精制瓊脂粉或瓊脂糖等。 【方法步驟】 1． ／L巴比妥緩沖液，在三角燒瓶內(nèi)加熱熔化。搖勻后迅速澆制瓊脂板。 4．向每孔加入不同稀釋度的待檢血清，其稀釋倍數(shù)分別是80。 5． ／L巴比妥緩沖液至槽高的2／3處。接通電源，調(diào)整電流強(qiáng)度在2～4mA／cm板寬。 6．電泳結(jié)束后，切斷電源，取下瓊脂板，如沉淀峰清晰可見，可直接判讀結(jié)果，否則將瓊脂板浸入10g／L鞣酸生理鹽水中10分鐘，可使沉淀峰更明顯。 【結(jié)果分析】 1．首先測量已知抗原的火箭峰高度，以此為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)濃度為縱坐標(biāo)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2．火箭峰高度與孔中抗原濃度呈正相關(guān)，與凝膠中抗體濃度呈負(fù)相關(guān)。 3．沉淀峰呈尖角狀表示無游離抗原，泳動已到終點(diǎn)；前端呈鈍圓形或云霧狀則表示還未到終點(diǎn)，應(yīng)繼續(xù)電泳。 5．與前述幾個(gè)電泳方法相比，火箭電泳操作簡便省時(shí)，結(jié)果重復(fù)性好，／m1。 【注意事項(xiàng)】 1．凝膠單擴(kuò)散中的注意事項(xiàng)在此均適用，例如加入抗體時(shí)要嚴(yán)格掌握瓊脂膠的溫度，抗原與抗體的濃度應(yīng)預(yù)先試驗(yàn)。 3．打孔完畢，可先將瓊脂板放在電泳槽上，低電流通電后再加樣，加樣后立即加大電流。這一做法適用于所有打孔加樣的凝膠電泳。4．，IgG、因此要使IgG、IgA等在電場中也向正極泳動，應(yīng)先經(jīng)乙?；⒓柞；虬奔柞；幚韥碓黾铀鼈兊呢?fù)電荷。 六 免疫電泳 【目的要求】本試驗(yàn)以鑒定人血清IgG提取物的純度為例，掌握免疫電泳的原理，熟悉操作方法，了解結(jié)果分析及臨床應(yīng)用。試驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，將樣品中不同分子量和不同電荷的組分分離成若干區(qū)帶；然后與電泳方向平行挖一小槽，加入含相應(yīng)抗體的免疫血清，與已分離的各抗原成分在瓊脂中作雙向免疫擴(kuò)散。根據(jù)沉淀弧的位置、數(shù)量和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。 2．試劑 兔抗人全血清、 ／L巴比妥緩沖液、12g／L瓊脂巴比妥液 凝膠、凝膠指示劑( )等。 【方法步驟】 1．瓊脂板制備 加熱熔化巴比妥瓊脂膠，用粗口吸管吸取4ml瓊脂膠，澆注到置于水平臺上的潔凈載玻片上。槽可用刀片劃制，也可用模具在澆注前放到載玻片上；打孔開槽時(shí)要求外壁整齊，防止瓊脂破裂。 2．加樣 用微量加樣器吸取正常人血清和待檢的人IgG各10μl分別加入兩個(gè)樣品孔中，注意不要外溢。 3．電泳 將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳。 4．雙擴(kuò)散 電泳后取出瓊脂板，向槽中加入預(yù)溫的瓊脂膠封底。將板平置濕盒內(nèi)，置37℃溫箱擴(kuò)散24h后觀察結(jié)果。根據(jù)正常人血清各蛋白成分所處的電泳位置可分為白蛋白(Alb)區(qū)、球蛋白α區(qū)、β區(qū)和γ區(qū)。如出現(xiàn)兩條以上沉淀線，則指示提取物不純。再將板浸入10～40g／L鞣酸水溶液中，10min后取出觀察，可增加沉淀線的清晰度。 4．免疫電泳的主要優(yōu)點(diǎn)不僅是加快沉淀反應(yīng)的速度，而且樣品用量少、特異性和分辨率高，可鑒定混合樣品中的不同抗原組分。 5．免疫電泳主要應(yīng)用于復(fù)雜抗原和抗體成分的分析、或其提取物的純度鑒定。