【正文】 帶。1. 瓊脂板制備：稱取1g瓊脂粉，加入100ml % NaCl溶液（禽類），煮沸使之溶解。2. 打孔：用打孔器在瓊脂凝膠板上按7孔梅花圖案打孔，孔徑約35mm，中心孔和周圍孔間的距離約為35mm。3. 封底：在火焰上緩緩加熱，使孔底瓊脂凝膠微微融化，以防止孔底邊緣滲漏。（1）血清流行病學(xué)調(diào)查：將禽流感瓊擴抗原置中心孔，周圍5孔加禽流感陽性血清，6孔分別加待檢雞血清，每加一個樣品應(yīng)換一個滴頭?；蛘呤菍⑿※Z瘟瓊擴抗原加入中心孔，周圍孔加入l:1:1:l:11:32等稀釋的小鵝瘟抗血清。或者是將雞傳染性法氏囊病陽性血清加入中心孔，周圍孔加雞傳染性法氏囊病瓊擴抗原（或待檢法氏囊組織浸提液）。6. 結(jié)果判定（1）血清流行病學(xué)調(diào)查：待檢孔與陽性孔出現(xiàn)的沉淀帶完全融合者判為陽性。（2）抗血清效價測定：以出現(xiàn)沉淀帶的血清最高稀釋倍數(shù)為抗血清的AGP效價。雞傳染性法氏囊病陽性血清與雞傳染性法氏囊病瓊擴抗原孔之間出現(xiàn)沉淀帶，如與待組織浸提液孔之間出現(xiàn)沉淀帶，說明該法氏囊組織中有雞傳染性法氏囊病病毒抗原。而一般抗原蛋白質(zhì)帶負電荷，在電泳力的作用下向正極移動。本法由于抗原抗體分子在電場作用下定向運動，限制了自由擴散，從而提高了敏感性，它較瓊脂擴散試驗敏感性高1016倍，并可大大縮短沉淀線出現(xiàn)的時間，適用于快速診斷。2. 打孔：孔徑35mm，孔距410mm，一張載玻片可打12個孔，挑去孔內(nèi)瓊脂，封底。4. 電泳：在電泳槽內(nèi)加入pH ，將濾紙片放入緩沖液內(nèi)浸濕搭橋?；螂娏鲝姸?5mA/cm，電泳時間為3090min 。陽性者則在抗原與抗體孔之間形成一條清楚致密的白色沉淀線。[思考題]1. 進行環(huán)狀沉淀試驗時，注意事項是什么？2. 瓊脂擴散沉淀試驗的操作方法及其應(yīng)用。羊紅細胞或雞細胞 + 免疫血清（溶血素）+ 豚鼠血清（補體） → 溶血反應(yīng)。由于補體對熱敏感，56℃ 30min即被滅活，室溫放置很快失活，010℃其活性僅能保持34d，實驗時可以采用新鮮的豚鼠血清。2. 掌握溶血試驗的操作與觀察結(jié)果的方法。2. 滅菌生理鹽水，2% 山羊紅細胞懸液，兔抗山羊紅細胞抗體（溶血素）， 2% 雞紅細胞懸液，兔抗雞紅細胞抗體（溶血素），豚鼠血清。2. 溶血素的制備：將免疫血清（溶血素）用生理鹽水稀釋成2單位（1:5001:1000），56℃水浴30 min滅活。4. 取小試管5支，依次編號。5. 結(jié)果觀察：若管底無紅細胞沉淀，上層液體紅色透明者為完全溶血。表31 溶血試驗（單位：ml ）試管號12溶血素對照3補體對照4鹽水對照5補、溶對照2%紅細胞溶血素——補 體—— *生理鹽水——結(jié) 果溶血不溶血不溶血不溶血不溶血注：* 56℃ 30min滅活的補體。通過HAHI試驗，可用已知血清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的相應(yīng)抗體和滴定抗體的含量。[材料與試劑]1. 96孔“U”形或“V”形微量反應(yīng)板，50mL定量移液器，滴頭，微型振蕩器。3. 新城疫病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），新城疫陽性血清，被檢雞血清。2. 于左側(cè)第1孔加50mL病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），混合均勻后，吸50mL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄50mL；第12孔為紅細胞對照。表 41 病毒血凝試驗的操作方法（單位：mL）孔 號123456789101112病毒稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048對照生理鹽水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 %紅細胞505050505050505050505050棄50結(jié)果觀察+++++++++++++++++++++++++++++++++ 4. 結(jié)果判定：從靜置后10 min開始觀察結(jié)果，待對照孔紅細胞已沉淀即可進行結(jié)果觀察。以100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位。(二) 血球凝集抑制(HI)試驗 1. 根據(jù)HA試驗結(jié)果，確定病毒的血凝價，配制出4個血凝單位的病毒液。3. 第１孔加被檢雞血清50mL，吹吸混合均勻，吸50mL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50mL，稀釋度分別為：1:２、1:1:8 …… ；第12孔加新城疫陽性血清50mL，作為血清對照。5. % 雞紅細胞懸液50mL，振蕩混合均勻，室溫下靜置后觀察結(jié)果（表42）。以100％抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價。從表42看出，該血清的HI效價為1:64，用以2為底的負對數(shù)(log2)表示，即6log2。2. % 雞紅細胞制備方法% 枸櫞酸鈉溶液(其量為所需血量的1／5)，從雞翅靜脈或心臟采血至需要血量，置滅菌離心管內(nèi)，加滅菌生理鹽水為抗凝血的2倍，以2000r/min離心10min，棄上清液，再加生理鹽水懸浮血球，同上法離心沉淀，如此將紅細胞洗滌三次，最后根據(jù)所需用量，% 雞紅細胞懸液。[思考題]1. HA和HI試驗的原理是什么？2. HI試驗是不是特異的抗原抗體反應(yīng)，為什么?3. HA和HI試驗有何實際應(yīng)用意義？實驗五 E玫瑰花環(huán)試驗動物的T淋巴細胞具有結(jié)合紅細胞的性質(zhì)，其分子基礎(chǔ)是T細胞表面存在CD2分子，也就是紅細胞受體，多數(shù)動物的T細胞是綿羊紅細胞受體，而豚鼠、馬的T細胞是家兔紅細胞受體，因此紅細胞能粘附到T細胞周圍形成一朵玫瑰花樣的花環(huán)，故取名為E玫瑰花環(huán)（erythrocyte rosettes），即紅細胞玫瑰花環(huán)，該試驗稱為E玫瑰花環(huán)試驗（erythrocyte rosettes assay）。該試驗可用于計數(shù)或分離E花環(huán)形成細胞以及測定機體的細胞免疫狀態(tài)。2. 熟悉淋巴細胞的分離方法。2. 淋巴細胞分層液，無鈣、鎂的Hank’s液，肝素液，小牛血清。4. GiemsaWeight 染色液：Ⅰ液： ml ，研磨混勻；Ⅱ液： ml 中，置60℃溫箱，最后加甲醇33 ml 即可；使用時，分別將Ⅰ液和Ⅱ。2. 方法2取豚鼠肝素抗凝血2 ml ，加等量Hank’s 液混合，沿離心管壁用毛細管緩緩加于2ml淋巴細胞分層液表面，置水平轉(zhuǎn)子離心機，2000r/min離心20min，用毛細管吸取血漿與分層液之間的乳白色淋巴細胞層，以Hank’s 液如上洗滌，再以Hank’s液配成細胞數(shù)為5106個/ml的懸液。 (二) 家兔紅細胞（RRBC）的制備1. 心臟采集家兔肝素抗凝血5 ml ，以2000r/min離心10min，棄上清液。（三）E花環(huán)形成細胞1. ml 淋巴細胞懸液，加10% ml ， ml 。3. 將細胞沉淀輕輕搖起，% ml ，混勻后4℃固定15 min。5. 自然干燥后，滴加甲醇固定5min，用GiemsaWeight 染色液染色，水洗，干燥鏡檢。每一標(biāo)本檢查200個淋巴細胞，按下列公式計算E玫瑰花環(huán)形成率。2. 為什么可以用E花環(huán)試驗檢測T細胞的數(shù)量？ 實驗六 EA玫瑰花環(huán)試驗B淋巴細胞上有免疫球蛋白的Fc受體， 以雞紅細胞作為指示細胞與相應(yīng)的抗紅細胞抗體形成EA，B淋巴細胞可以通過Fc受體與EA結(jié)合，形成EA玫瑰花環(huán)，在顯微鏡下可以觀察到吸附有紅細胞的B淋巴細胞，以此計算B淋巴細胞的數(shù)目。此方法簡單，目前較常采用，以檢測B淋巴細胞的百分率。2. 熟悉淋巴細胞的分離方法。2. 淋巴細胞分層液，無鈣、鎂的Hank’s液，肝素液，姬姆薩染色液，1% 戊二醛溶液，95% 乙醇，2%鹽酸溶液等。從雞翅下靜脈采血，用肝素抗凝，以Hank’s液洗滌3次，最后配成4% 的細胞懸液。[操作方法]1. 分離淋巴細胞， X 106個/ml細胞懸液。 3. ，加入等量的4% 的EA懸液，混勻，室溫作用30min，1000r/min離心5min，吸棄過多的上清液，置4℃ 24h。5. 以懸液制片，自然干燥，滴加姬姆薩染色液染色2min，加自來水繼續(xù)放置15min，沖洗，將玻片置95% 酒精缸腿色1530S（以脫成淺紫藍色為度），再置鹽酸液缸（按1% HCl 1份與自來水2份）脫色10S左右（呈淡蘭略帶紅色為度），取出沖洗，干燥鏡檢。[注意事項]1. 加入淋巴細胞與雞紅細胞的比例一般以1:4