原位雜交與凋亡檢測(cè)技術(shù)-文庫(kù)吧資料
2025-05-19 00:53本頁(yè)面
【正文】 性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體時(shí)混入免疫組化的第一抗體。 注意事項(xiàng)： 先做原位雜交（因 mRNA易被降 解），后做免疫組化。 七、原位雜交結(jié)合免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記法： 原位分子雜交檢測(cè) DNA或 RNA， 能進(jìn)行基因定位或在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)； 免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白抗原 成分，在翻譯水平上研究基因表達(dá)。 （ 2）陽(yáng)性著色強(qiáng)度：按弱、中、強(qiáng)三 級(jí)分別為 3分。 RNA原位雜交的陽(yáng)性信號(hào)位于胞漿內(nèi)。 1酒精脫水，二甲苯透明，封片。 1 PBS 洗 5分鐘 4次。 1 PBS洗 5分鐘 3次。 1 PBS洗 5分鐘 3次。 滴加封閉液：室溫 20分鐘，不洗。 滴加雜交探針?lè)€(wěn)定液 37400C 反應(yīng)46小時(shí)（此步可省略）。 DNA雜交： 切片置于 2 SSC中，微波爐加熱 95~ 100℃ 10分鐘；迅速插入冰水 2分鐘； DNA探針于 90 ℃ 水中 10分鐘 ,迅速插入碎冰 3分鐘； 雜交：切片在空氣干燥后，按每張切片加 20μl含地高辛標(biāo)記的 DNA/RNA探針原位雜交液，將原位雜交專(zhuān)用蓋玻片的保護(hù)膜揭開(kāi)后，蓋在切片上，恒溫箱 37 ~ 400C過(guò)夜。 暴露 DNA/mRNA核酸片段： (1) DNA: 蛋白酶 K（ 10ug/ml) 室溫消化10分鐘； （ 2） RNA:胃蛋白酶 370C消化 30分鐘。 六、原位雜交實(shí)際操作舉例： DNA 與 mRNA原位雜交步驟 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟到水。 空白試驗(yàn)：用未標(biāo)記探針或不加探針 的雜交液進(jìn)行雜交。 吸收試驗(yàn)：用 cDNA或 cRNA探針進(jìn)行預(yù)雜交。 （十）對(duì)照實(shí)驗(yàn)：根據(jù)實(shí)際情況定。 （ 九）顯示（使用檢測(cè)系統(tǒng)）： 放射自顯影（略）。 鹽溶液（ SSC） 濃度由高到低，溫度 由低到高。 組織切片置于盛有 2 SSC溶液的濕盒中孵育。加硅化蓋玻片（無(wú)菌蠟?zāi)ひ部桑? （六） 預(yù)雜交：用不含探針和硫酸葡聚糖的液體封閉非特異性雜交點(diǎn)。 雜交后酶處理。 （四）、增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性： Triton X100 蛋白酶 K（ Proteinase K 1ug/ml） 37 0C 15~20 min 胃蛋白酶（ Pepsin 20~100ug/ml） 37 0C 30 min 上述酶消化后用 4%多聚甲醛后固定。 （三）防止 RNA酶污染： 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均需戴消毒手套。 玻片粘附劑：多聚賴(lài)氨酸， APES。 （一）固定： DNA 較穩(wěn)定， mRNA次之， RNA 最易被酶降解。 核 DNA和 RNA 的 mRNA的排列和運(yùn)輸，復(fù)制和細(xì)胞分類(lèi) 細(xì)胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷、腫瘤診斷 病毒學(xué)和病原學(xué)、傳染性疾病的診斷 生物學(xué)劑量的測(cè)定 五、原位雜交技術(shù)的基本方法： 包括： 雜交前準(zhǔn)備：固定、取材、 玻片和組織處理，增強(qiáng)核酸探針的穿透性，減低背景染色等。 特點(diǎn)：鏈短，雜交速度快，特異性強(qiáng)，價(jià)廉質(zhì)穩(wěn)。 特點(diǎn)：長(zhǎng)度隨意，穩(wěn)定，信號(hào)更強(qiáng)。單鏈較好。 單鏈：將 DNA片段裝載到質(zhì)?；蚓w中，以此為模板用 Taq酶合成互補(bǔ)單 DNA探針或以 RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈 cDNA探針。 特點(diǎn)：靈敏度也高，安全，快速，廣泛應(yīng)用。 特點(diǎn)：靈敏度高，輻射危害，耗時(shí)久，半衰期限制。 1983年 Brigat首建生物素標(biāo)
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