dna印跡與雜交技術(shù)-文庫(kù)吧資料
2025-05-13 18:05本頁(yè)面
【正文】 胞合成代謝時(shí)使 核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?3H胸苷可摻入到 DNA中， 3H尿苷可摻入到 RNA中 體外標(biāo)記法： 化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的活性基因與 探針?lè)肿由系哪承┗蚍磻?yīng)， 標(biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由? 酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然 后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸 摻入到探針上 酶促標(biāo)記法 切口平移法（ nick translation) 利用 DNase I在 DNA雙鏈上造成單鏈切口 利用大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 5??3?核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從 5?末端逐步切除 在 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合酶催化下，以互補(bǔ)的 DNA單鏈為模板依次將 dNTP連接到切口的 3?末端 OH上，合成新的 DNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的 DNA鏈中 隨機(jī)引物法 其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈 DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在 DNA聚合酶的催化下，按 5??3?方向合成一新的 DNA鏈，其核苷酸序列與模板 DNA完全互補(bǔ)。 Southern雜交 預(yù)雜交：封閉膜上能與 DNA結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含 DNA探針的雜交液 雜交：液相中的 DNA探針與膜上的待測(cè) DNA雜交 雙鏈 DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA 6. 雜交結(jié)果的檢測(cè) 化學(xué)顯色或放射自顯影 標(biāo)記的探針 探針 探針技能，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測(cè)的一種技能，我們把標(biāo)記的分子叫探針（ Probe） 從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移 對(duì)于分子量較大的 DNA片段，必須進(jìn)行 原位斷裂后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂 DNA分子最佳長(zhǎng)度為 12kb。 iii) 真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。 各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 毛細(xì)管虹吸法：操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低 ,（擴(kuò)散法為 70%，毛細(xì)管法 80%）耗時(shí)多。 （ 2）電轉(zhuǎn)法 利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。缺點(diǎn)是 DNA分子結(jié)合不牢固 ②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈 DNA的能力比硝酸 纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高 ③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)： DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同 大小的 DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能 力較上述兩種膜低 Southern印跡的常用方法 （ 1）毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 4. Southern轉(zhuǎn)膜 (印跡 ) 待測(cè)定核酸分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（如纖維素膜）上，即印跡。 材料： 尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜、
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